Isolierung und Charakterisierung antitumoral wirkender Substanzen aus karibischer Propolis mit Schwerpunkt auf Verbindungen mit spezifischen anti-Krebsstammzellen-Eigenschaften

Ziel dieser Arbeit war die Isolierung von antitumoral wirksamen Substanzen aus kubanischer Propolis, die in Tieren eine antitumorale Aktivität aufweist. Diese Substanzen kommen als Kandidaten für die Entwicklung von Chemotherapeutika in Betracht, die chemotherapie-refraktäre Krebsstammzellen spezifisch angreifen können. Für diese Absicht wurden als biologisches Untersuchungssystem chemotherapie-resistente und nicht resistente Zelllinien unterschiedlicher Krebsarten etabliert, wobei die resistenten Zelllinien eine Reihe von Charakteristika von Krebsstammzellen aufweisen. Mit diesem System konnten 18 wirksame Substanzen in Reinform isoliert werden. Aufgrund der chemischen Komplexität der kubanischen Propolisspezies wurde sie in drei Areale aufgetrennt, wobei in A acht, in B zwei und in C wiederum acht wirksame Substanzen gefunden worden sind. Areal A enthielt fünf Substanzen, deren Struktur und Namen bereits bekannt sind, dazu eine bisher unbekannte und zwei weitere Verbindungen, bei denen keine Strukturaufklärung möglich war. Die identifizierten Substanzen gehören zu den Flavonoiden, Isoflavonoiden und Chalkonen. In Areal B wurden Nemoroson und Retusapurpurin A identifiziert. In Areal C sind die allermeisten Verbindungen der Gruppe der PPAP zuzuordnen. Das Areal enthält die bereits bekannten Substanzen Propolon A und DEHP, drei bisher unbekannte PPAP, deren Struktur aufgeklärt werden konnte, und drei PPAP-ähnliche Substanzen, von denen aber keine endgültigen Strukturen vorliegen. Molekularbiologische Analysen zur Aufklärung der Wirkmechanismen der isolierten Verbindungen ergaben, dass Laxifloran und Conferol A aus Areal A starke Tubulinpolymerisierungshemmer sind. Die Wirkmechanismen der restlichen Substanzen bleiben offen. Die Wirkmechanismen der Verbindungen aus Areal B sind in der Literatur gut beschrieben und lagen daher nicht im Fokus dieser Arbeit. In Areal C wurde DEHP als starker Hemmer der Topoisomerasen I und II sowie die DNA-Polymerase identifiziert. Für zwei PPAP (CZ4-1-2 und CZ4-2) wurde in den Zellen eine Inhibition der enzymatischen Aktivität der Signaltransduktionselemente c-Raf, MEK1/2 und ERK1/2 beobachtet, was ein wichtiger Wirkmechanismus für diese Substanzen darstellen könnte. Für die restlichen Substanzen konnten bislang keine Wirkmechanismen entschlüsselt werden. Ein bedeutsames Ergebnis dieser Arbeit ist die Identifizierung von neun Verbindungen, die eine deutliche Wirkung in hoch hemotherapie-refraktären Krebszellen zeigen. Diese Eigenschaft ist klinisch relevant, weil solche Substanztypen in Patienten zum Einsatz kommen könnten, die eine Resistenz gegen die Standardtherapien entwickelt haben. Außerdem könnten diese Verbindungen als Leitsubstanzen für die Entwicklung neuartiger Medikamente benutzt werden. Die detaillierte Aufklärung der Wirkweise der Substanzen und die Analyse ihrer Zielstrukturen sollen zukünftige Forschungsschwerpunkte sein, ebenso wie die Untersuchung ihrer akuten und chronischen Toxizität sowie ihrer antitumorale Aktivität im Tiermodell.

The aim of this thesis was the isolation of antitumoral active compounds from Cuban propolis. Those compounds are interesting candidates for the development for novel chemotherapeutics, which target the resistant cancer stem cells (CSC). For this purpose we established a broad panel of resistant and non resistant cell lines of different cancer species, in which the resistant cancer cells show properties of CSC. Employing this cell panel and successive HPLC cycles we isolated 18 active substances in a pure form. Due to the chemical complexity the Cuban propolis was divided into three areas, where area A contained eight, area B two and area C eight cytotoxic substances. Five out of the eight substances in area A were already known and are belonging to the chemical classes of flavonoids, isoflavonoids and chalcones (A3-2, A4-6, A5-3 & A6). Additionally there was one un-known xanthone (A4-7) and two substances without a structure (A2-3 & A4-5). Area B consisted of nemorosone (B1) and retusapurpurine A (RNP). Most of the substances in area C were members of the polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols (PPAP). Beside of propolone A (C4-2-1) and DEHP (CZ6) there were three unknown PPAP with an identified chemical structure (CZ4-1-1, CZ4-2 & CZ4-3) and another three unidentified compounds (C4-2-2, CZ4-1-2 & CZ5). Molecular biological analyses for the clarification of the mechanism of action of the isolated substances showed that A3-2 and A4-6 were strong inhibitors of tubulin polymerization. The mechanism of action for the other compounds of area A remained unknown. The substances of area B with their mechanism of action were well described in the literature and because of that not in the focus of this thesis. DEHP from area C was a strong inhibitor of topoisomerases I and II as well as of the DNA polymerase. CZ4-1-2 and CZ4-2 blocked the activity of the signal transduction elements c-Raf, MEK1/2 and ERK1/2 in the cells. The mechanisms of action of the remaining area C substances were not identified. A major result of this thesis was the identification of nine compounds, which are highly active in therapy-refractory cancer cells. This is clinical important, because those agents can be used for patients who developed a radio- and chemotherapy-refractory tumor. Furthermore these substances can be used as lead structures for novel drugs. A detailed clarification of the mechanisms of action and identification of the cellular targets of the propolis substances should be the aim and focus of future research, as well as analyses of acute or chronic toxicity and antitumorale activity of the compounds in an in vivo animal model.

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