Intravenous drug users (IDUs) are a major risk group for hepatitis C infection in Germany. In fact 73% of IDUs living in Germany are HCV seropositive while only 27% of IDUs are HCV seronegative. The frequently reported shared use of injection equipment suggests that the majority of HCV seronegative IDUs have also been exposed to HCV, raising the question why these IDUs do not seroconvert and if they might have some kind of natural resistance to HCV infection. NK cells represent a major subset of intrahepatic lymphocytes and certain NK cell phenotypes have been associated with HCV infection outcome. NK cells are regulated by a complex network of activating and inhibiting receptors. Interestingly, homozygosity for the inhibiting NK cell receptor gene KIR2DL3 and its ligand HLA-C1 has been associated with HCV clearance and resistance to HCV. However, the functional mechanisms underlying this protective effect by genetic predisposition remain elusive. In this study we comparatively analyzed the phenotype and function of NK cells of IDUs with chronic HCV infection, resolved HCV infection and seronegative IDUs. Our results show that NK cells of seronegative IDUs are characterized by higher frequencies of NKp46, KIR2DL3 and NKG2C and lower frequencies of NKG2A. In line with a functional benefit of higher NKp46 expression levels, we observed increased CD107a production by NK cells of seronegative IDUs when NK cells were activated via NKp44 and NKp46. A more detailed analysis of NKG2A and KIR2DL3 revealed significantly higher frequencies of KIR2DL3+NKG2A- NK cells in HCV seronegative IDUs. In addition, we showed an inverse correlation between KIR2DL3 and NKG2A expression, suggesting that KIR2DL3 may potentially serve as a tag for NKG2A expression rather than playing a causal role for the previously described protective effects itself. Analysis of liver biopsy samples revealed increased transcription levels of HLA-E, the NKG2A ligand, in liver biopsies of HCV infected patients correlating with HCV viral load. In vitro experiments with primary human hepatocytes demonstrated that HLA-E transcription and protein expression were upregulated by IFN-α. To elucidate the influence of HLA-E on the KIR2DL3+NKG2A- NK cells of seronegative IDUs, we stimulated NK cells of healthy individuals with HLA-E high and low expressing target cells and analyzed CD107a and IFN-γ production. Total NK cells and KIR2DL3-NKG2A+ NK cells were inhibited in the presence of HLA-E high expressing target cells, while KIR2DL3+NKG2A- NK cells were not inhibited in the presence of HLA-E. Furthermore, we were able to show that NK cells of chronically HCV infected IDUs were potently inhibited in the presence of HLA-E while NK cells of seronegative IDUs showed no inhibition. We suggest a model in which HCV productively infects hepatocytes and causes type I interferon-mediated HLA-E upregulation. In this setting KIR2DL3-NKG2A+ NK cells, predominantly found in chronically HCV infected individuals, are potently inhibited by HLA-E allowing ongoing HCV replication and persistent infection, while KIR2DL3+NKG2A- NK cells, characteristically found in seronegative patients, can readily respond and eliminate HCV infection before seroconversion. Expansion of this “protective” NK cell phenotype in HCV seronegative IDUs could be the consequence of distinct NK cell education/licensing or a different NK cell differentiation stage. In favor of distinct education of NK cells in HCV seronegative IDUs we did not observe a statistically significant difference in CD57 expression as a marker of advanced differentiation of NK cells. This would be in line with previous genetic association studies linking a particular KIR/KIR-ligand genotype with favorable HCV outcome. However, there was at least a trend towards higher CD57 expression on NK cells of HCV seronegative IDUs, suggesting that an advanced differentiation state my partly contribute to the phenotype. Interestingly, the NK cell phenotype in HCV seronegative IDUs resembles the NK cell phenotype described upon HCMV infection. Collectively, our data indicate that there might be more than one path to the generation of the favorable KIR2DL3+NKG2A- NK cell phenotype. While some patients have the NK cell phenotype by genetic predisposition others may develop it as a consequence of infections such as HCMV. A prospective study analyzing potential changes of the NK cell phenotypes, HCV infection status and HCMV infection status over a longer period of time is needed and would allow to gain new insights into the dynamics of the interaction between NK cells and HCV infection.   7 Zusammenfassung Patienten mit intravenösem Drogenabusus („intravenous drug users“, IDUs) stellen eine Hauptrisikogruppe für Hepatitis-C-Virusinfektionen in Deutschland dar. In Deutschland sind 73% aller IDUs HCV seropositiv und nur 27% HCV seronegativ. Da Injektionsutensilien häufig von mehreren Personen geteilt werden, sind mit hoher Wahrscheinlichkeit nahezu alle IDUs einschließlich der seronegativen Patienten HCV exponiert. Dies wirft die Frage auf, warum diese Gruppe der IDUs keine akute Infektion entwickelt und ob sie eine Art „natürliche Resistenz“ gegen eine HCV-Infektion haben. NK-Zellen sind eine wichtige Population intrahepatischer Lymphozyten und unterschiedliche NK-Zellphänotypen wurden bei unterschiedlichen HCV-Infektionsverläufen beschrieben. NK-Zellen werden durch ein komplexes Netzwerk aus aktivierenden und inhibierenden Rezeptoren reguliert. Patienten, die für das Gen des inhibierenden NK-Zellrezeptors KIR2DL3 und seinen Liganden HLA-C1 homozygot sind, haben eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, eine HCV-Infektion spontan auszuheilen oder erst gar nicht infiziert zu werden. Allerdings bleibt der funktionelle Mechanismus für diesen protektiven Effekt ungeklärt. In dieser Studie haben wir den Phänotyp und die Funktion der NK-Zellen von IDUs mit chronischer HCV-Infektion, ausgeheilter HCV-Infektion und HCV seronegativen IDUs vergleichend analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die NK-Zellen HCV seronegativer IDUs durch höhere Frequenzen von NKp46, KIR2DL3 und NKG2C sowie einer niedrigeren Frequenz von NKG2A charakterisiert sind. In Einklang mit der erhöhten NKp46 Frequenz wiesen NK-Zellen von HCV seronegtiven IDUs einen funktionellen Vorteil durch erhöhte CD107a Produktion auf, wenn sie über NKp44 und NKp46 stimuliert wurden. Eine detaillierte Analyse von NKG2A und KIR2DL3 zeigte statistisch signifikant erhöhte Frequenzen von KIR2DL3+NKG2A- NK Zellen bei HCV seronegativen IDUs. Zusätzlich konnten wir eine inverse Korrelation zwischen der Expression von KIR2DL3 und NKG2A zeigen. Es erscheint daher möglich, dass KIR2DL3 lediglich als Marker für eine niedrige NKG2A-Expression fungiert und selbst gar nicht für den ihm zugeschrieben protektiven Effekt verantwortlich ist. Die Analyse von Leberbiopsien HCV-infizierter Patienten zeigte eine erhöhte Transkription des NKG2A-Liganden HLA-E sowie eine Korrelation mit der Höhe der Viruslast. In primären humanen Hepatozyten wurde sowohl die HLA-E Transkription als auch die Proteinexpression durch Stimulation mit IFN-α erhöht. Um den Einfluss von HLA-E auf die KIR2DL3+NKG2A- NK-Zellen seronegativer IDUs weiter zu untersuchen, wurden NK-Zellen gesunder Individuen mit aktivierenden Zellen stimuliert, die entweder eine hohe oder eine niedrige HLA-E-Expression aufwiesen. In der Analyse von CD107a und IFN-γ Expression zeigte sich, dass die Gesamtpopulation der NK-Zellen sowie die Teilpopulation der KIR2DL3-NKG2A+ NK- Zellen in Anwesenheit von HLA-E inhibiert werden. Im Gegensatz dazu wurden die KIR2DL3+NKG2A- NK-Zellen nicht durch HLA-E inhibiert. Weiterhin konnten wir zeigen, dass NK-Zellen von chronisch mit dem HCV infizierten IDUs aber nicht NK-Zellen von HCV seronegativen IDUs wirksam durch die Anwesenheit von HLA-E inhibiert wurden. Wir schlagen hier ein Modell vor, in dem das HCV Hepatozyten infiziert und über Induktion von Typ I Interferonen HLA-E auf Hepatozyten hochreguliert. In diesem System werden KIR2DL3-NKG2A+ NK-Zellen, die vorwiegend in chronisch infizierten Patienten gefunden werden, effizient durch HLA-E gehemmt, was eine weitere HCV Replikation ermöglicht und in einer persistierenden Infektion resultiert. Im Gegensatz dazu können KIR2DL3+NKG2A- NK-Zellen der HCV seronegativen IDUs aktiviert werden und die Infektion kontrollieren, bevor es zur Serokonversion kommt. Die Expansion dieser „protektiven“ NK-Zellen könnte die Folge einer speziellen NK-Zell-Lizensierung oder einer veränderten Differenzierung sein. Für die spezielle Lizensierung spricht, dass wir keine statistisch signifikanten Unterschiede bei dem Differenzierungsmarker CD57 feststellen konnten. Die spezielle Lizensierung wäre auch im Einklang mit der genetischen Assoziation zwischen bestimmten KIR/KIR-Liganden-Kombinationen und einem vorteilhaften HCV-Infektionsverlauf. Allerdings war zumindest eine Tendenz zu erhöhter Expression von CD57 auf NK-Zellen von seronegativen IDUs erkennbar, so dass ein fortgeschrittener Differenzierungsgrad der NK-Zellen zum „protektiven“ Phänotyp beitragen könnte. Interessanterweise ähnelt der NK-Zellphänotyp der HCV seronegativen IDUs dem Phänotyp nach einer HCMV Infektion. Zusammengefasst, weisen unseren Daten darauf hin, dass es mehr als einen Weg zu dem günstigen KIR2DL3+NKGA- NK Zell Phänotyp geben könnte. Während einige Patienten diesen Phänotyp als Konsequenz ihrer Immungenetik haben, resultiert er bei anderen möglicherweise aus einer Infektion zum Beispiel mit CMV. Eine Studie, die die Dynamik des NK-Zell-Phänotyps, sowie den HCV- und HCMV-Infektionsstatus über einen längeren Zeitraum untersucht, würde neue Einsichten in die Rolle von NK-Zellen bei der HCV-Infektion ermöglichen.