Function of DNA Ligase III in the Repair of Radiation induced DNA Double Strand Breaks via alternative Pathways of Non-homologous End Joining functioning as Backup
Among the variety of lesions that are induced by ionizing radiation, the most critical one is the DNA double strand break (DSB). DSBs are highly cytotoxic lesions and if left unrepaired or are misrepaired can lead to chromosomal aberrations and induction of apoptosis or can result in mutations, genomic instability and carcinogenesis. Cells of higher eukaryotes use two major repair pathways to repair their DSBs: homologous recombination repair (HRR) and non homologous end-joining (NHEJ). Previous biochemical and genetic studies from our lab support the view that vertebrates remove DSBs from their genomes predominantly by two non-homologous end joining (NHEJ) pathways, termed D-NHEJ and B-NHEJ. While D-NHEJ depends on the well characterized activities of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) and LIG4/XRCC4/XLF complexes, the activities and the mechanisms of the alternative, backup NHEJ are less well characterized. Previous studies from our laboratory implicated LIG3 together with PARP in B NHEJ and histone H1 as an alignment factor. Notably, the contribution of LIG1 to B-NHEJ remains conjectural and although biochemical, cytogenetic and genetic experiments implicate LIG3, this contribution has not been formally demonstrated.
DNA ligase III (LIG3) is beside DNA ligases I (LIG1) and IV (LIG4) one of three mammalian DNA ligases, unique in that it is restricted to vertebrates. The LIG3 gene of higher eukaryotes generates four distinct DNA ligase polypeptides that serve nuclear and mitochondrial functions. The mitochondrial and nuclear versions LIG3α are synthesized from LIG3 mRNA by an alternative translation initiation mechanism. This N-terminal mitochondrial leader sequence is a unique characteristic of LIG3 that is not shared by any of the other remaining ligases.
To conclusively examine the function of LIG3 in B-NHEJ we generated a series of knockouts in the DT40 system system in cooperation with Hiroshi Arakawa from Helmholtz Center Munich. While LIG1-/- and LIG4-/- mutants are viable and grow normally, LIG3 knockout is lethal. Therefore, conditional knockout models were developed and combined with knockouts of all other DNA ligases to study the functions of LIG1 and LIG3 in DSB repair.
To study the role of LIG1 in DSB repair we knocked out this ligase in wt and LIG4-/- genetic background to generate cells deficient in LIG1-/- and double mutants deficient in LIG1-/-LIG4-/-. There is no effect on the repair of DSBs measured by PFGE in LIG1-/- cells suggesting that this ligase has no measurable contribution to the repair of this form of DNA lesion. LIG4-/- cells show a pronounced defect in DSB repair due to the inhibition of D-NHEJ. However, these cells are capable of repairing the majority of IR induced DSBs using B-NHEJ. The repair of the generated double LIG1-/-LIG4-/- knockout mutant was indistinguishable from that of LIG4-/- cells providing thus conclusive evidence that a. LIG1 is not required for the repair of DSBs either by B-NHEJ or D NHEJ, if LIG3 is present and functional and b. that LIG3, the only remaining DNA ligase in this mutant, is an integral component of B-NHEJ. The results were confirmed at low doses in gamma-H2AX foci kinetics and in cell survival assays.
In addition, our results confirm, that LIG3 is essential for survival of higher eukaryotic cells due to its function in the mitochondria. In line with other studies, the LIG3 knockout lethality can be rescued by expression of a ligase endowed with a mitochondria specific targeting sequence. To conclusively determine the role of LIG1 in DSB repair, we took advantage of these findings and developed a genetic system devoid of LIG3. Therefore we generated cells expressing hLIG1 with a mitochondrial targeting sequence (mts hLIG1) in the LIG3-/-LIG4-/- genetic background. DSB repair studies of the generated LIG3 / LIG4 / mts hLIG1 mutants show a DSB processing with no difference in comparison to double LIG1-/-LIG4-/- knockout mutants. Since these mutants express only the endogenous chicken LIG1 and the overexpressed mitochondrial human LIG1, we can conclude that also LIG1 is able to support DSB repair by B-NHEJ.
In summary, the results obtained expand the functions of LIG1 to alternative NHEJ and demonstrate a remarkable ability for LIG3 to backup DSB repair by B-NHEJ, in addition to its essential function in the mitochondria. Together with our recent results on DNA replication, these observations uncover a remarkable and previously unappreciated functional flexibility and interchangeability between LIG1 and LIG3 in B NHEJ.
Unter der Vielzahl von Läsionen, die durch ionisierende Strahlung induziert werden, gilt der Doppelstrangbruch (DSB), falls nicht oder falsch repariert, als Ursache von Chromosomenaberrationen die zum Zelltod führen, wie auch als Ursache von Mutationen und genomischer Instabilität, die die Entstehung von Krebs verursachen können. Zellen höherer Eukaryonten können DSBs entweder durch nicht homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder durch homologe Rekombinationsreparatur (HRR) aus reparieren. Frühere biochemische Studien von unserem Labor haben gezeigt, dass die große Mehrheit der DSB durch zwei Reparaturwege von NHEJ entfernt werden können, die als D-NHEJ und B-NHEJ bezeichnet werden. Während D-NHEJ von DNA-PK und vom LigaseIV/XRCC4/XLF Komplex abhängig ist, benutzt B NHEJ, neben PARP-1 als Reparaturkomponente und Histon H1 als Alignment Faktor, wahrscheinlich LigaseIII/XRCC1. In kürzlich veröffentlichten Publikationen wurde auch über eine Beteiligung von LIG1 im B-NHEJ gemutmaßt.
In Säugerzellen ist DNA Ligase III (LIG3) neben Ligase I (LIG1) und IV (LIG4) eine von insgesamt drei funktionierenden DNA Ligasen und ist interessanterweise beschränkt auf Wirbeltiere. Das Gen von LIG3 produziert vier verschiedene Polypeptide in der Form von nuklearen und mitochondrialen Versionen von LIGIIIα und LIG3β. Die nukleare und mitochondriale Variante von LIG3α werden ständig aus derselben mRNA durch eine alternative Initiierung der Translation hergestellt, und unterscheiden sich durch eine mitochondriale Targetingsequenz, die den Transport in die Mitochondrien ermöglicht. Diese N-terminale mitochondriale Leadersequenz ist ein Sondermerkmal von LIG3 und tritt bei keiner der anderen Wirbeltierligasen auf.
Um die Funktion von LIG3 im B-NHEJ zu untersuchen wurden für diese Arbeit eine Vielzahl an Knockout und Knockin Mutanten im DT40 Hühnerzellsystem in Zusammenarbeit mit Dr. Hiroshi Arakawa, der am Helmholtz Zentrum München tätig ist, hergestellt. Bei der Generierung der Mutanten zeigte sich schnell, dass LIG3 essentiell ist und die Zellen ohne LIG3 sterben. Deshalb wurde für LIG3 der Weg des konditionellen Knockouts gewählt.
Der konventionelle Knockout von LIG1 und LIG4 stellte kein Problem dar und so konnten neben einfachen Mutanten auch die Doppelmutante LIG1-/-LIG4-/- hergestellt werden. In DNA Reparaturexperimenten mittels Puls-Feld Gelelektrophorese (PFGE) zeigte sich in dieser Doppelmutante LIG1-/-LIG4-/-, dass LIG3, die einzige vorhandene Ligase in diesen Zellen, effektiv im B-NHEJ DSBs repariert. Die Ergebnisse wurden durch Experimente bei niedrigeren Dosen durch gammaH2AX Foci-Bildung und Überlebenskurven bestätigt.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Funktion von LIG3 in den Mitochondrien essentiell ist und die Dysfunktion der Mitochondrien zeitgleich mit dem Eintreten des Zellsterbens auftritt. Die Letalität des LIG3 Knockout kann jedoch umgangen werden, wenn die Mitochondrien der Zellen mit einer anderen Ligase versorgt werden, d.h. eine andere Ligase eine mitochondriale Leadersequenz aufweist. Diese Eigenschaft wurde in dieser Arbeit genutzt, um den kompletten LIG3 Knockout zu verwirklichen. Auf diese Weise wurden die Mutante LIG3-/-LIG4-/-mts-hLIG1 hergestellt, die nur LIG1 besitzt und exprimiert. Diese neue Mutante wurde ebenfalls in DSB Reparaturexperimenten mittels PFGE und in Überlebenskurven eingesetzt. Hier konnte gezeigt werden, dass auch LIG1 in der Lage ist im B-NHEJ DSB zu reparieren.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass sowohl LIG3 und LIG1 als alleinige Ligase im B-NHEJ robust DBSs reparieren können. Dies stellt eine beindruckende und vorher nur vermutete funktionelle Flexibilität von LIG1 und LIG3 im B-NHEJ zu arbeiten dar.
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