Konditionale Überexpression des Transkriptionsfaktors HNF1β und dessen Einfluss auf die Nierenentwicklung von Xenopus laevis
Der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis ist ein attraktives Modell, um die frühe Entwicklung von Vertebraten auf molekularer und zellularer Ebene zu untersuchen. Die Transparenz der Larven ermöglicht eine effiziente Beobachtung der zahlreichen morphologischen Veränderungen während der Organogenese. <br><br>
In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des gewebespezifischen Transkriptionsfaktors HNF1β insbesondere in der Nierenentwicklung von Xenopus laevis näher charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde das binäre Cre/loxP-System mit Aktivator- und Effektorstämmen verwendet. In diesem System kann die Cre-Rekombinase konditional durch einen Hitzeschock aktiviert werden.<br><br>
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass die Transkription der Cre-Rekombinase sowohl im HSPCre1- und im HSPCre13-Aktivatorstamm durch einen einstündigen Hitzeschock effizient aktiviert wird und beide Stämme als Aktivatorstämme für das Cre/loxP-System verwendet werden können.<br><br>
Durch Kreuzung des C5-Stammes mit dem HSPCre1-Stamm wurde gezeigt, dass bereits eine Stunde nach Beginn des Hitzeschocks Transkripte eines induzierbaren Reportergens detektierbar waren. <br><br>
Die HSPCre13 vermittelte Überexpression der P328L329del-Mutation durch einen einstündigen Hitzeschock führte zu Nierendefekten und Fehlentwicklungen anderer Organe. Es wiesen jedoch nicht alle mutanten Larven Nierendefekte auf. Dieses Ergebnis konnte in weiteren Kreuzungen mit unabhängigen Aktivator- und Effektorstämmen bestätigt werden.<br><br>
Nach der Optimierung des binären Cre/loxP-Systems durch einen zweistündigen Hitzeschock konnte gezeigt werden, dass die ubiquitäre Überexpression der P328L329del- Mutation in allen mutanten Larven zu einem Nierenphänotyp führte. Insgesamt war die Niere signifikant verkleinert. Zusätzlich interferierte die Überexpression mit der Entwicklung des Magen-Darm-Traktes, des Schwanzes und des Auges.
Durch die Analyse ausgewählter Marker für die einzelnen Segmente des sich entwickelnden Pronephros konnte gezeigt werden, dass die Überexpression des mutanten Derivates P328L329del die Expression der Gene slc3a1 und tmem27, welche spezifisch in den proximalen Tubuli exprimiert werden, beeinflusste. Beide Gene spielen eine Rolle bei der renalen Reabsorption von Aminosäuren. Dieses Resultat enthüllt eine neue Rolle von HNF1β in der Nierenphysiologie.
Larven in denen das mutante HNF1β-Derivat A263insGG ubiquitär aktiviert war, wiesen ebenfalls Defekte der Niere, des Magen-Darm-Traktes, des Schwanzes und des Auges auf. Im Gegensatz zu dem durch die Überexpression von P328L329del verursachten Nierenphänotyp, war die Niere hier signifikant vergrößert. Die Überexpression von HNF1β hatte hingegen keinen Einfluss auf die Larvenentwicklung.
Desweiteren konnten zwei neue Effektorstämme etabliert werden, mit denen HNF1β und das mutante Derivat P328L329del im Gegensatz zu den vorherigen Experimenten ausschließlich im Pronephros überexprimiert werden können. Es konnte gezeigt werden, dass die pronephrosspezifische Überexpression von HNF1β mit der Entwicklung der Niere und des Magen-Darm-Traktes interferierte. Im Schwanzbereich und im Auge wurden keine Defekte beobachtet.<br><br>
Weiterhin wurde eine neue Methode in Xenopus laevis getestet und optimiert, bei der die lokale Hitzeschockaktivierung eines Gens mittels Laserbestrahlung erfolgt. Mit dieser Methode war es möglich, das EYFP-Reportergen des C5-Stammes lokal in einzelnen Schwanzmuskelzellen und im Pronephros zu aktivieren. Diese Methode wurde in dieser Arbeit erstmalig in Xenopus laevis angewandt und ermöglicht eine gewebespezifische Überexpression von Genen ohne die Verwendung gewebespezifischer Promotoren.
The frog Xenopus laevis is an excellent model system to analyze the molecular processes involved in early embryogenesis and organogenesis. The advantages include a large number of embryos and the development that takes place outside the maternal body allowing for a continuous observation of morphogenetic events in the highly transparent larvae.
In this work the function of the tissue specific transcription factor HNF1β was examined particularly in kidney development of Xenopus laevis. For this purpose it was made use of the binary Cre/loxP-system with activator and effector strains. In this system the Cre recombinase can be conditionally activated by a heat-shock.
Transcription of the cre recombinase is efficiently activated by a one hour heat-shock in both the HSPCre1 and HSPCre13 strain. Therefore both strains can be used as activator strains in the binary Cre/loxP-system.
A crossing of the C5 strain with the HSPCre1 strain revealed that transcripts of an inducible reporter gene could be detected already one hour after heat-shock-activation of the cre recombinase.
Ubiquitous overexpression of the HNF1β derivative P328L329del by a one-hour heat-shock caused kidney defects and malformations of other organs in the mutant larvae, but this was not the case in all of these animals. This result was validated with additional crossings of independent activator and effector strains.
The binary system was optimized by application of a two hour heat-shock and upon ubiquitous overexpression of P328L329del 100 % of the mutant larvae showed a kidney phenotype, which became manifested in defects particularly in the proximal tubules and in a significantly reduced kidney size. Additionally the overexpression of P328L329del interfered with the development of the gut, the tail and the eye. Furthermore the expression of the two proximal tubule markers slc3a1 and tmem27 was affected. Both genes play a crucial role in the renal absorption of amino acids. This finding reveals an unknown function of HNF1β in kidney development. The overexpression of the HNF1β derivative A263insGG also caused malformations of the kidney, gut, tail and eye in mutant larvae. In comparison to animals with activated P328L329del the kidney size was significantly increased. The overexpression of HNF1β had no effect on development.
Furthermore two new effector strains for pronephros specific overexpression of HNF1β and the mutant derivative P328L329del were established. The pronephros specific overexpression of HNF1β led to kidney defects and gut malformations. In contrast to the ubiquitous overexpression no malformations of tail and eye were observed.
In addition a new method was established where a local heat-shock is induced by laser beams. With this approach it was possible to activate the inducible EYFP reporter gene in single cells of the tail and in the pronephros. This method was applied in Xenopus laevis for the first time and allows for a tissue specific gene activation without the need of tissue specific promoters.
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