Nina Susanne Seiwert

• Dickdarmkrebs (kolorektales Karzinom, KRK) ist die dritthäufigste Krebserkrankung weltweit. Der Lebenswandel, insbesondere die Ernährungsgewohnheiten, zählen zu den bedeutendsten Risikofaktoren für KRK. Dabei steht Häm-Eisen, welches hauptsächlich durch den Verzehr von rotem Fleisch aufgenommen wird, im Verdacht, das KRK-Risiko zu erhöhen. Es wird vermutet, dass Häm-Eisen durch die Bildung endogener N-Nitrosoverbindungen (NOCs) und reaktiver Sauerstoffspezies sowie durch eine gesteigerte Proliferation des Kolonepithels die Entstehung des KRK fördert. NOC-induzierte Alkylierungsschäden der DNA, insbesondere mutagene O6-Methylguanin-Läsionen (O6-MeG), die durch die O6-MeG-DNA-Methyltransferase (MGMT) repariert werden, könnten in der Ätiologie von KRK von Bedeutung sein. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der Häm-Eisen-vermittelten kolorektalen Kanzerogenese sind jedoch wenig verstanden und wurden in der vorliegenden Arbeit näher untersucht. Der Fokus dieser Arbeit lag einerseits auf der Untersuchung der Wirkung von Häm-Eisen auf das intestinale Mikrobiom und auf intestinale Entzündungsprozesse. Andererseits wurde die Bildung kanzerogener NOCs, sowie die durch sie verursachten DNA-Schäden und die DNA-Schadensantwort bzw. -reparatur näher analysiert. Zu diesem Zweck wurden wildtypische (WT), DNA-reparaturkompetente Mäuse mit einer Häm-Eisen-haltigen Diät gefüttert, wohingegen die Kontrollgruppe eine eisenbalancierte Diät mit Zusatz von Eisencitrat erhielt. Die Rolle der DNA-Reparatur wurde durch Verwendung transgener Mäuse, die einen Knockout des MGMT Gens (MGMT-/-) besitzen, untersucht. Zunächst konnte beobachtet werden, dass Häm-Eisen die endogene Bildung fäkaler NOCs steigerte, was mit einer erhöhten Fäkalwasser-Zytotoxizität in vitro in humanen Darmepithelzellen verbunden war. Weiterhin reduzierte Häm-Eisen die Zellviabilität intestinaler Kryptorganoide ex vivo. In vivo induzierte diätisches Häm-Eisen DNA-Doppelstrangbrüche (γH2AX) in intestinalen Epithelzellen, welche mit der Stabilisierung von p53 einhergingen. Zudem wurde in peripheren Blutzellen aus MGMT-/- Mäusen ein Anstieg von γH2AX in T-Zellen nach Häm-Eisen beobachtet. Eine Hyperproliferation des Kolonepithels durch Häm-Eisen zeigte sich als Zunahme PCNA-positiver Zellen sowie mitotischer Figuren, die zusammen mit der beobachteten reduzierten Apoptoserate einen kompensatorischen Mechanismus gegenüber den Häm-Eisen-vermittelten Schäden im Kolonepithel darstellen könnte. Die Analyse des intestinalen Mikrobioms mittels 16S rRNA-Sequenzierung ergab eine Häm-Eisen-abhängige Reduktion der α-Diversität sowie eine frühe intestinale Dysbiose, die über 162 Tage persistierte. Diese korrelierte mit einem Anstieg gramnegativer Bakterien, während die Abundanz der grampositiven Arten abnahm. Weiterhin wurde das intestinale Entzündungsmuster mittels nicht-invasiver Mini-Endoskopie mit anschließender Bestimmung des Inflammationsgrades (murine endoscopic index of colits severity, MEICS) analysiert. Diese Untersuchungen ergaben eine chronische Kolitis nach der Häm-Eisendiät, die zudem mit einer Aktivierung des intestinalen Immunsystems, einer Infiltration von B- und T-Zellen und einem Anstieg inflammatorischer Marker (pSTAT-3, COX-2) im Dickdarmgewebe einherging. Zur Analyse der tumorpromovierenden Eigenschaften von Häm-Eisen wurde WT Mäusen der kolonotrope Tumorinitiator Azoxymethan (AOM) verabreicht und diese in einer Langzeitstudie mit Häm-Eisen- oder Eisencitrat-haltiger Diät gefüttert. Durch die Anwendung einer Mini-Endoskopie wurde gezeigt, dass Häm-Eisen tumorpromovierend wirkt und die Anzahl sowie die Größe der AOM-induzierten Tumore erhöht. Interessanterweise wurden sogar tumorinitiierende Eigenschaften von diätischem Häm-Eisen in MGMT-/- Tieren festgestellt, wohingegen keine Initiation in WT Tieren beobachtet wurde. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass diätisches Häm-Eisen eine chronische Kolitis auslöst, die mit einer Aktivierung des intestinalen Immunsystems und einer persistierenden Dysbiose des Darmmikrobioms verbunden ist. Zusätzlich förderte Häm-Eisen kolorektale Tumore durch die beobachteten tumorpromovierenden Eigenschaften. In MGMT-/- Mäusen, nicht aber in WT Mäusen, führte diätisches Häm-Eisen sogar ohne initiale AOM-Injektion zur signifikant vermehrten Entstehung kolorektaler Tumore. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Häm-Eisen bei einer Inaktivierung von MGMT, was in 40 % der sporadischen kolorektalen Karzinome beim Menschen der Fall ist, KRK sowohl initiieren als auch promovieren kann.
• Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. Lifestyle, especially nutrition, is one of the most important risk factors for CRC. Heme iron, which is mainly consumed via red meat, is suspected to increase the risk of CRC. It is thought to promote CRC development via the formation of endogenous N-nitroso compounds (NOCs), reactive oxygen species and an enhanced proliferation of the colonic epithelium. NOC-induced alkylation damage of DNA, in particular mutagenic O6-methylguanine lesions (O6-MeG), which are repaired by O6-MeG-DNA methyltransferase (MGMT), might be important in the etiology of CRC. However, the underlying molecular mechanisms of heme iron-mediated colorectal carcinogenesis are poorly understood and have been further investigated in this study. The present work focused on the impact of heme iron on the intestinal microbiome and on intestinal inflammatory processes. Furthermore, the formation of carcinogenic NOCs as well their DNA damaging properties together with the DNA damage response and repair were analysed. For this purpose, wild type (WT) DNA repair proficient mice were fed a diet containing heme iron, whereas the control group received an iron-balanced diet suppplemented with iron citrate. The role of DNA repair was investigated by using transgenic mice with a knockout of the MGMT gene (MGMT-/-). First, heme iron increased endogenous formation of fecal NOCs, associated with increased fecal water cytotoxicity in vitro in human intestinal epithelial cells. Furthermore, heme iron reduced the cell viability of intestinal crypt organoids ex vivo. In vivo, dietary heme iron triggered DNA double-strand breaks (γH2AX) in intestinal epithelial cells associated with the stabilization of p53. Additionally, peripheral blood cells from MGMT-/- mice showed an elevated level of γH2AX-foci in T cells after heme iron. The hyperproliferation of the colonic epithelium caused by heme iron was found as an increase in PCNA-positive cells and mitotic figures, which, together with the observed reduced apoptosis rate, could represent a compensatory mechanism against heme iron-mediated damage in the colonic epithelium. Analysis of the intestinal microbiome by 16S rRNA sequencing revealed a heme iron-dependent decrease of α-diversity and an early intestinal dysbiosis persisting for 162 days. This correlated with a higher number of gram-negative bacteria, while gram-positive species decreased. Furthermore, the intestinal inflammation pattern was analyzed using a non-invasive mini endoscopy with subsequent determination of the inflammation severity (murine endoscopic index of colits severity, MEICS). These studies revealed a chronic colitis after a heme iron diet, accompanied by an activation of the intestinal immune system, an infiltration of B- and T-cells and an increase of inflammatory markers (pSTAT-3, COX-2) in the colon tissue. To analyze the tumor-promoting properties of heme iron, WT mice were injected with the colonotropic tumor initiator azoxymethane (AOM) and fed with a heme iron- or iron citrate-containing diet in a long-term study. Here, mini endoscopic analysis revealed a tumor-promoting effect of heme iron by increasing the number and size of AOM-induced tumors. Intriguingly, heme iron indicated tumor initiating properties in MGMT-/- animals, while no initiation was observed in WT animals. In summary, dietary heme iron was shown to induce a chronic colitis associated with an activation of the intestinal immune system and persistent gut microbial dysbiosis. Addionally, the progression of colorectal tumors could be stimulated by the tumor-promoting potential of heme iron. In MGMT-/- mice, but not in WT mice, a heme iron diet resulted in colorectal tumors even without initial AOM injection, which was significantly different from WT. These results suggest that heme iron can both initiate and promote CRC when MGMT is inactivated, which occurs in 40 % of human sporadic colorectal cancers.