Dokument: Isolation and Structure Elucidation of Secondary Metabolites from Fungi

Titel:Isolation and Structure Elucidation of Secondary Metabolites from Fungi
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20170531-100214-4
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Liu, Yang [Autor]
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Dateien vom 24.05.2017 / geändert 30.05.2017
Beitragende:Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter]
Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Endophytische Pilze sind Mikroorganismen, die in gesunden Pflanzen leben und ihrem Wirt keinen Schaden zufügen. In den letzten Jahren entdeckte man, dass endophytische Pilze die Fähigkeit besitzen, die gleichen Verbindungen wie ihre Wirte zu produzieren, was den Fokus von bioaktiven Naturprodukten von Pflanzen auf endophytische Pilze verschob. Viele Sekundärmetabolite aus Pilzen z.B. Plinabulin, Cyclosporin A, Simvastatin oder Cephalosporin C werden bereits als Arzneimittel oder Prodrugs verwendet. Die erfolgreiche Anwendung dieser Verbindungen verstärkte die Forschung in Richtung bioaktiver Sekundärmetabolite aus endophytischen Pilzen.

Die einzelnen Untersuchungen, die diese Dissertation beinhaltet, konzentrieren sich hauptsächlich auf bioaktive Sekundärmetabolite aus endophytischen Pilzen, sowie Ko-Kultivierung, um unter Laborbedingungen nicht-exprimierte Gen-Cluster zu aktivieren. Es konnten mehrere zytotoxische und antibakterielle Verbindungen aus den bearbeiteten Endophyten isoliert werden, welche für weitere Studien interessant sind. Die Strukturen der Sekundärmetabolite wurden per 1D (1H und 13C), 2D (HSQC, HMBC, COSY, ROESY) NMR-Spektroskopie, sowie HR-ESI-MS-Spektrometrie, als auch mittels Circulardichroismus Spektroskopie (ECD) bestimmt. Darüber hinaus wurden die Reinsubstanzen hinsichtlich ihrer Zytotoxizität gegenüber der murinen Lymphomzelllinie L5178Y und der menschlichen Lymphomzelllinien Ramos und Jurkat J16, sowie hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis und Mycobacterium tuberculosis getestet.

Insgesamt konnten 26 Sekundärmetabolite aus zwei endophytischen Pilzen, Stemphylium globuliferum und Annulohypoxylon sp., sowie einem hypersalinen Bodenpilz Cladosporium cladosporioides isoliert werden. Neun dieser Verbindungen wurden als neue Naturprodukte identifiziert und eine als neu beschriebenes Artefakt. Alle Substanzen wurden hinsichtlich ihrer antibiotischen und zytotoxischen Aktivität evaluiert. Diese Dissertation besteht aus den folgenden vier Teilen, die bereits in wissenschaftlichen Journalen publiziert oder zum Publizieren eingereicht wurden:

Endophytischer Pilz Stemphylium globuliferum

Der Pilz Stemphylium globuliferum wurde aus der Pflanze Juncus actus isoliert, welche am Ufer des hypersalinen Sees El Hamra im Wadi El Natrun, Ägypten, gesammelt wurde. Es konnten dreizehn Sekundärmetabolite aus dem Rohextrakt isoliert werden. Sechs davon wurden als neue Naturprodukte identifiziert, namens Stemphylanthranol A, Stemphylanthranol B, Dihydroaltersolanol B, Dihydroaltersolanol C und die Atropisomere Acetylalterporriol D und Acetylalterporriol E. Hierbei wurden Stemphylanthranol A und B als erste natürlich vorkommende trimere Anthrachinonderivate identifiziert. Dihydroaltersolanol B und C sind Derivate von Altersolanol B und C, bei denen die Doppelbindung des aliphatischen Rings hydriert wurde. Der Unterschied der neuen Atropisomere Acetylalterporriol D und E zu den Alterporriolen D und E war die Acetylierung der Hydroxygruppe (3-OH). Altersolanol A-C, Dihydroaltersolanol C, Acetylalterporriol E, Alterporriol E und 6-O-methylalaternin zeigten starke zytotoxische Aktivität gegenüber der murinen Lymphomzelle L5178Y mit IC50-Werten zwischen 1,25 und 10,4 μM. Zudem zeigte Dihydroaltersolanol C auch moderate antibakterielle Aktivität gegen S. aureus mit einer minimalen Hemmkonzentration (MIC) von 49.7 μM.

Boden-Pilz Cladosporium cladosporioides

Der Pilz Cladosporium cladosporioides wurde aus dem Sediment des hypersalinen Sees El Hamra in Wadi El Natrun, Ägypten isoliert. Vier Sekundärmetabolite wurden aus dem Rohextrakt von C. cladosporioides isoliert, von denen einer der neue Sekundärmetabolit Cladosporinon war. Alle isolierten Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer zytotoxischen Aktivität gegenüber der murinen Lymphomzellline L5178Y und ihrer antibiotischen Aktivität gegen mehrere pathogene Bakterien untersucht. Viriditoxin, der Hauptsekundärmetabolit des Rohextraktes, fiel besonders auf Grund seiner selektiven Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus ATCC 29213 mit einem MIC-Wert von 0.015 μg/mL (0.023 μM) auf. Der neue Sekundärmetabolit Cladosporinon ist ein Viriditoxin-Derivat, welches nur zytotoxische Aktivität zeigte. Die Struktur-Wirkungs-Beziehung der Verbindungen wurde anhand ihrer zytotoxischen und antibiotischen Aktivität erörtert. Der vorgeschlagene Polyketid-Biosyntheseweg des Viriditoxins und seiner Derivate wird diskutiert.

Mangroven-Endophyt Annulohypoxylon sp.

Der endophytische Pilz Annulohypoxylon sp. wurde aus der Mangrovenpflanze Rhizophora racemosa, die in Kamerun gesammelt wurde, isoliert. Aus dem Rohextrakt konnten neun Sekundärmetabolite isoliert werden. Es handelte sich hierbei um zwei neue Benzo[j]fluoranthen-basierende Metabolite (Daldinon E und Daldinon G), sowie ein neues Artefakt (Daldinon F), das während des Isolierungsprozesses aus Daldinon E entstand. Kultivierungsexperimente von Annulohypoxylon sp. mit dem Aktinomyzeten Streptomyces lividans resultierten in einer 38-fachen Zunahme von 1-Hydroxy-8-methoxynaphthalen. Im Gegensatz dazu konnte während der Ko-kultivierung des Pilzes mit Bacillus subtilis oder mit Bacillus cereus keine signifikante Induktion detektiert werden. Daldinon F zeigte starke bis moderate Zytotoxizität gegenüber den Ramos- und Jurkat J16-Zelllinien mit IC50 Werten von 8,5, bzw. 13,89 μM. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Daldinon F über den intrinsischen Weg eine Caspase-3-Aktivierung bewirkt und somit die Apoptose induziert. Desweiteren blockiert Daldinon F wirksam die Autophagie, welche einen potentiellen Signalweg für das Überleben der Krebszellen darstellt. Ein Biosyntheseweg für die Benzo[j]fluoranthen-Derivate beinhaltet die oxidative Kopplung zwischen 1,3,8-Trihydroxynaphthalen (3HN) und 1,8-Dihydroxynaphthalen (DHN). Ein Fütterungsexperiment mit DHN erhöhte die Akkumulation von Daldinon B im Pilzextrakt, was dem vorgeschlagenen Biosyntheseweg der Benzo[j]fluoranthen Derivative entspricht.

Endophytic fungi are microorganisms that colonize the inner tissues of healthy plants without causing any apparent disease symptoms. In recent years, the focus of bioactive natural products research has shifted from plants to endophytic fungi, as the latter of them have the capacity to produce the same bioactive agents originally found in their host plants. Several fungal secondary metabolites are already used as drugs or lead compounds, such as plinabulin, cyclosporin A, simvastatin or cephalosporin C, indicating that endophytes are a rich source of bioactive natural products with a huge pharmaceutical potential.
The projects involved in this dissertation mainly focus on the isolation of bioactive secondary metabolites from axenic cultures of endophytic or soil-derived fungi, as well as from fungal-bacterial co-cultivation experiments, with the aim of activating silent gene clusters that are not expressed under standard laboratory culture conditions. The structures of the isolated secondary metabolites were elucidated by 1D (1H and 13C), 2D (HSQC, HMBC, COSY, ROESY) NMR spectroscopy, and HRESIMS spectrometry, as well as by electronic circular dicrosim (ECD) spectroscopy. The pure substances were investigated for their cytotoxicity toward the murine lymphoma cell line L5178Y, and against human lymphoma Ramos and Jurkat J16 cell lines, as well as for their antibiotic activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, and Mycobacterium tuberculosis.
In summary, 26 secondary metabolites were obtained from two endophytic fungi Stemphylium globuliferum and Annulohypoxylon sp., as well as from the hypersaline lake derived fungus Cladosporium cladosporioides. Nine of the isolated metabolites were identified as new natural products. This dissertation consists of the following three parts, which have led to four publications.
Metabolites from the endophytic fungus Stemphylium globuliferum

Stemphylium globuliferum was isolated from the plant Juncus actus, which was collected from the shore of the hypersaline lake El Hamra located in Wadi el Natrun in Egypt. Thirteen secondary metabolites were isolated from the crude extract, including six new natural products, stemphylanthranol A, stemphylanthranol B, dihydroaltersolanol B, dihydroaltersolanol C, and the atropisomers acetylalterporriol D and acetylalterporriol E. Notably, stemphylanthranols A and B were identified as the first naturally occurring trimeric anthraquinone derivatives. Altersolanols A–C, dihydroaltersolanol C, acetylalterporriol E, alterporriol E, and 6-O-methylalaternin showed strong cytotoxicity against the murine lymphoma (L5178Y) cell line with IC50 values ranging from 1.25 to 10.4 μM. Furthermore, dihydroaltersolanol C exhibited moderate antibacterial activity against S. aureus with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 49.7 μM.

Metabolites from the hypersaline lake derived fungus Cladosporium cladosporioides

The fungus Cladosporium cladosporioides was isolated from the sediment of the hypersaline lake El Hamra located in Wadi el Natrun in Egypt. Four secondary metabolites were isolated from the crude extract of C. cladosporioides, one of which was identified as a new viriditoxin derivative, designated cladosporinone. All isolated compounds were investigated for their cytotoxicity against the murine lymphoma cell line L5187Y and for their antibiotic activity against several pathogenic bacteria. Viriditoxin was by far the most active compound, exhibiting selective activity against Staphylococcus aureus ATCC 29213 with an MIC value of 0.015 μg/mL (0.023 μM). Moreover, viriditoxin and its new congener cladosporinone showed strong cytotoxicity with IC50 values of 0.15 and 0.88 μM, respectively. The structure activity relationships of the isolated compounds were discussed based on their activities in the respective cell lines.

Metabolites from the mangrove-derived endophytic fungus Annulohypoxylon sp.

The endophytic fungus Annulohypoxylon sp. was isolated from the Mangrove plant Rhizophora racemosa collected in Cameroon. Nine secondary metabolites were obtained from the crude extract, including two new benzo[j]fluoranthene-based metabolites daldinone E and daldinone G, as well as an artefact, daldinone F, which originated from daldinone E during the isolation procedure. Co-cultivation of Annulohypoxylon sp. with Streptomyces lividans or with Streptomyces coelicolor resulted in an up to 38-fold increase of 1-hydroxy-8-methoxynaphthalene, while no significant induction was detected when the fungus was co-cultivated with either Bacillus subtilis or with Bacillus cereus. Daldinone F exhibited strong to moderate cytotoxicity against Ramos and Jurkat J16 cell lines with IC 50 values of 8.5 and 13.9 μM, respectively. Mechanistic studies suggested that daldinone F caused apoptosis by activating caspase-3 via the intrinsic pathway. Moreover, daldinone F potently blocks autophagy, a potential pro-survival pathway for cancer cells. The biogenetic pathway of the isolated benzo[j]fluoranthene derivatives is suggested to start with the oxidative coupling between 1,3,8-trihydroxynaphthalene (3HN) and 1,8-dihydroxynaphthalene (DHN). Feeding experiments with DHN which was added to the growing fungal culture increased the accumulation of daldinone B, which is in accordance with the proposed biogenetic pathway of benzo[j]fluoranthene derivatives.
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Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:31.05.2017
Dateien geändert am:31.05.2017
Datum der Promotion:22.08.2016
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