Dokument: Charakterisierung des murinen Guanylat-bindenden Proteins 2 (mGBP2)

Titel:Charakterisierung des murinen Guanylat-bindenden Proteins 2 (mGBP2)
Weiterer Titel:Characterization of the murine guanylate-binding protein 2 (mGBP2)
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20121221-125600-9
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor:Dr. Kravets, Elisabeth [Autor]
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Dateien vom 20.12.2012 / geändert 20.12.2012
Beitragende:Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Betreuer/Doktorvater]
Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:Interferon-γ (IFN-γ) induzierbare Guanylat-bindende Proteine, Toxoplasma gondii, parasitophore Vakuole (PV), Pathogenabwehr, Zell-autonome Immunität, Wirt-Pathogen-Interaktion, GTPase-Funktion
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Das Ziel dieser Arbeit war die biochemische und immunologische Charakterisierung des IFN-γ induzierten murinen Guanylat-bindenden Proteins 2 (mGBP2). Mit Hilfe von GTPase-Mutanten wurden Erkenntnisse gewonnen, die zum Verständnis der Prozesse der Nukleotidbindung und Oligomerisierung und zur Aufklärung vom Mechanismus der Hydrolyse von GTP zu GMP beitragen. Die biochemischen Eigenschaften von mGBP2 bilden den Rahmen, in dem es seine biologische Funktion im zellautonomen Abwehrsystem gegen Pathogene ausüben kann. Dabei konnte im Rahmen dieser Arbeit die Funktion einzelner Domänen und der Isoprenylierung für die subzelluläre Lokalisation und für die immunologische Funktion bei der T. gondii Infektion aufgeklärt werden.
Die experimentellen Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mGBP2 Fluoreszenz-markierte Guanin-Nukleotide mit Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich bindet, wobei die Affinitäten zum GTP-Analogon mant-GTPγS, sowie mant-GDP 30-fach höher sind als für mant-GMP. Unter physiologischen Bedingungen liegt das Protein daher überwiegend im GTP-gebundenen Zustand vor und der Nukleotidaustausch kann unabhängig von Austauschfaktoren erfolgen. Die Aminosäuren K51 und D182 in der P-Schleife bzw. dem G4 Nukleotid-Bindemotiv von mGBP2 partizipieren direkt an der Nukleotidbindung, wobei die Letztere vermutlich für die spezifische Erkennung der Guaninnukleotide verantwortlich ist. Ein Austausch dieser Aminosäuren resultiert in mutierten Proteinen K51A bzw. D182N mit deutlich verringerten Nukleotid-Bindungskapazitäten.
Die Hydrolyse von GTP durch mGBP2 erfolgt unter konsekutiver Abspaltung der a- und b-Phosphate unter Bildung eines GDP-gebundenen Intermediats und resultiert in der Produktion sowohl von GDP als auch von GMP, wobei bei 37°C GMP das Hauptprodukt ist. Ein Indiz für die Sukzessivität der beiden Hydrolyseschritte ist die Unfähigkeit von mGBP2 aus der Lösung gebundenes GDP zu GMP umzusetzen. Die GTP-Hydrolyse von mGBP2 ist kooperativ und die spezifische Aktivität ist abhängig von der Proteinkonzentration. Dieses kooperative Verhalten beruht auf einer nukleotidabhängigen Oligomerisierung der mGBP2-Moleküle. Größenausschlusschromatographische Experimente zeigen, dass das mGBP2 Protein im GTPγS- und GDP-gebundenen Zustand Dimere bildet und im Komplex mit GDP und Aluminiumfluorid, welcher den Übergangszustand der Hydrolysereaktion nachahmt, weiter zu Tetrameren assembliert. Die Aminosäure E99 in der Switch II Region von mGBP2 ist in die Hydrolysereaktion involviert und ihre Mutation führt, wahrscheinlich durch die Inhibition der Flexibilität der Switch II Region, zur verringerten Aktivität und GMP-Produktion. Das konservierte Arginin in der P-Schleife von mGBP2 erfüllt die Funktion des „Arginin-Fingers“ und stabilisiert das, während der Hydrolysereaktion entstehende, Oligomer. Die Mutation der Isoprenylierungsstelle von mGBP2 hat in dem verwendeten System keinen Einfluss auf die Nukleotid-Bindung bzw. Hydrolyse von GTP.
Die funktionale Analyse des endogenen mGBP2 Proteins in murinen embryonalen Fibroblasten, sowie des wildtypischen GFP-Fusionsproteins in rekonstituierten mGBP2-/- Zellen zeigt, dass mGBP2 nach IFN-γ Stimulation in vesikelartigen Strukturen im Zytosol lokalisiert vorliegt. Anhand der GFP-Fusionsproteine der GTPase-Mutanten konnte nachgewiesen werden, dass diese Verteilung sowohl der GTPase-Aktivität als auch der Isoprenylierung bedarf und durch IFN-γ induzierbare Faktoren verstärkt wird.
Die Analyse der Replikation des Typ II T. gondii Stammes ME49 zeigte, dass mGBP2 die Proliferation des Parasiten attenuiert und dadurch wahrscheinlich dessen Ausbreitung verhindert. Das Protein rekrutiert IFN-γ abhängig zur parasitophoren Vakuole (PV) von T. gondii. Die Zielsequenz für die Rekrutierung zur PV und die Kontrolle über die parasitäre Replikation ist in der C-terminalen E-Domäne von mGBP2 kodiert. Die Lipidmodifikation des Proteins ist erforderlich sowohl für die vesikuläre Verteilung als auch für die Interaktion mit dem Erreger. Die GTPase-Aktivität erhöht die Effizienz der Rekrutierung in der frühen Phase der Infektion und vermittelt dessen anhaltende Effektorfunktion an der PV des Parasiten.
mGBP2 geht Interaktionen mit anderen mGBP Proteinen ein. Dadurch könnten GTPase-Aktivität, subzelluläre Lokalisation und immunologische Spezifität und Variabilität der Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene reguliert werden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die GTPase Aktivität und die subzelluläre Lokalisation in vesikulären Strukturen Voraussetzungen für eine anti-mikrobielle Effektorfunktion von mGBP2 bei der Abwehr von T. gondii Infektion darstellen.

The aim of this study was the biochemical and immunological characterization of IFN-γ inducible murine guanylate-binding protein 2 (mGBP2). By means of GTPase mutants, insights were gained into the processes of nucleotide binding, oligomerization and into the mechanism of hydrolysis of GTP to GMP. The biochemical properties of mGBP2 provide a framework within which it exerts its biological function in cell-autonomous defense system against pathogens. This study determines the function of individual domains and the isoprenylation of mGBP2 for the subcellular localization and immunological function in T. gondii infection.
The experimental results of this study show that mGBP2 binds fluorescence-labeled guanine nucleotides with dissociation constants in the micromolar range, while the affinities for the GTP analog mant-GTPγS and mant-GDP are 30-fold higher than for mant-GMP. Under physiological conditions, the protein is therefore predominantly present in the GTP-bound state and the nucleotide exchange can take place independently of exchange factors. The amino acids K51 and D182 in the P-loop and the G4 nucleotide binding motif of mGBP2 participate directly in the nucleotide binding, while the latter one could be responsible for the specific recognition of guanine nucleotides. An exchange of these amino acids results in mutant proteins K51A and D182N with significantly reduced nucleotide-binding capacity.
During hydrolysis of GTP mGBP2 cleaves the a- and b-phosphates in a consecutive manner forming a GDP-bound intermediate. The reaction results in the production of both GDP and GMP, with GMP as the main product at 37°C. One indication of the successiveness of the two hydrolysis steps is the inability of mGBP2 to convert solution bound GDP to GMP. The GTP hydrolysis by mGBP2 is cooperative and the specific activity depends on the protein concentration. This cooperative behavior is stimulated by the nucleotide dependent oligomerization of the mGBP2 molecules. Size exclusion chromatography experiments indicate that the protein forms dimers in the GTPγS- and GDP-bound state and further assembles to tetramers in complex with GDP and aluminum fluoride, which mimics the transition state of hydrolysis. The amino acid E99 in the switch II region of mGBP2 is involved in the hydrolysis reaction and its mutation leads to reduced activity and GMP production, probably by inhibiting the flexibility of the switch II region. The conserved arginine in the P-loop of mGBP2 fulfills the function of the "arginine finger" and stabilizes the oligomeric structure during the hydrolysis reaction. In the system used the mutation of the isoprenylation site of mGBP2 has no influence on nucleotide binding or hydrolysis of GTP.
The functional analysis of the endogenous mGBP2 in murine embryonic fibroblasts, as well as of the wild-type GFP-fusion protein in reconstituted mGBP2-/- cells shows that after IFN-γ stimulation mGBP2 localizes in vesicle-like structures in the cytosol. Using the GFP-fusion proteins of the GTPase mutants it could be shown that this distribution requires both the GTPase activity and the isoprenylation and is enhanced by IFN-γ inducible factors.
The analysis of replication of T. gondii type II strain ME49 revealed that mGBP2 attenuates the proliferation of the parasite, thereby probably preventing its spread. The protein recruits to the parasitophorous vacuole of T. gondii (PV) in an IFN-γ dependent manner. The target sequence for the recruitment to the PV and for the control over the parasitic replication is encoded in the C-terminal E-domain of mGBP2. The lipid modification of the protein is required for the vesicular distribution as well as for the interaction with the pathogen. The GTPase activity increases the efficiency of recruitment in the early phase of infection and mediates its ongoing effector function at the PV of the parasite.
mGBP2 interacts with other mGBP proteins. These interactions could regulate the GTPase activity, subcellular localization and immunological specificity and variability of the defense against intracellular pathogens.
In summary, it was shown that the GTPase activity and the subcellular localization in vesicular structures are prerequisites for an anti-microbial effector function of mGBP2 in defense against T. gondii infection.
Quelle:Institut für medizinische Mikrobopligie und Krankenhaushygiene
Lizenz:In Copyright
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Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:21.12.2012
Dateien geändert am:21.12.2012
Promotionsantrag am:06.08.2012
Datum der Promotion:14.12.2012
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