Dokument: Bacterial Cytochrome P450 Monooxygenases: Investigations on Redox Partners and Optimization for Whole-Cell Biocatalysis
| Titel: | Bacterial Cytochrome P450 Monooxygenases: Investigations on Redox Partners and Optimization for Whole-Cell Biocatalysis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16804 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101123-120629-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Girhard, Marco [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Cytochrom P450; Monooxygenase; CYP109B1; CYP152A2 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Selektivoxidation von C-H Bindungen stellt in der synthetischen organischen Chemie ein weitgehend ungelöstes Problem dar. Diese Reaktion kann hingegen von Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450 oder CYP) bei Raumtemperatur in einem einzigen Reaktionsschritt bewerkstelligt werden, was diese Enzymklasse für industrielle Biotransformationen hochinteressant macht. Cytochrom P450 Enzyme gehören zur Familie Häm b enthaltender Monooxygenasen und katalysieren die Spaltung von molekularem Sauerstoff, wofür zwei Elektronen benötigt werden. Diese werden in den meisten Fällen ausgehend von den Cofaktoren NADH oder NADPH über externe Redoxproteine (Reduktasen und Flavodoxine oder Ferredoxine) auf die Hämdomäne des P450 übertragen.
Durch die Entdeckung und Charakterisierung neuer P450 mit unterschiedlichen Substratspezifitäten und Aktivitäten wird die Diversität von biotechnologisch relevanten Reaktionen bzw. Produkten erweitert. Dafür steht ein stetig wachsender Pool von derzeit mehr als 18.000 annotierten P450-Sequenzen zur Verfügung. Allerdings wurde bisher nur ein Bruchteil dieser neuen P450 funktionell exprimiert und charakterisiert. Ursächlich dafür sind unter anderem folgende Limitierungen: 1) Die Identifizierung von geeigneten Redoxpartnern, die sowohl für die Herstellung der P450-Aktivität, als auch eine effiziente Biokatalyse mit P450 essentiell notwendig sind, ist oftmals schwierig. So befinden sich zum Beispiel die Gene von physiologischen Redoxproteinen meist nicht vor- oder nachgelagert des P450-Gens im Genom. 2) Ferner ist die physiologische Funktion neuer P450 oft unbekannt, so dass keine Aussagen über deren potentielle Substrate getroffen werden können, was die Suche und Auswahl geeigneter P450-Kandidaten zeit- und arbeitsintensiv macht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue bakterielle P450 Enzyme, CYP109B1 aus Bacillus subtilis und CYP152A2 aus Clostridium acetobutylicum charakterisiert, ihre oxidative Aktivität mit Hilfe von verschiedenen Redoxpartnern hergestellt, und das biotechnologische Potential beider Enzyme untersucht. CYP109B1 wurde mittels Durchmusterung einer Bibliothek von 242 rekombinant in E. coli exprimierten P450 aus Bakterien und Pilzen gefunden, da es als einziger Kandidat das verwendete Substrat (+)-Valencen regio- und chemoselektiv zu Nootkatol und (+)-Nootkaton oxidierte. (+)-Nootkaton ist ein Aromastoff, der natürlicherweise in lediglich geringen Mengen in Grapefruitölen vorkommt und Einsatz als Duft- und Geschmacksstoff in Parfüms und Lebensmitteln findet. Im Folgenden wurde die Produktion von (+)-Nootkaton im größeren Maßstab mit einem rekombinanten E. coli Stamm durchgeführt, der CYP109B1 zusammen mit (nicht-physiologischen) Redoxproteinen exprimierte. Auf Basis dieses Ganzzell-biokatalysators konnten im Zweiphasensystem mit nicht-wassermischbaren organischen Lösemitteln unter optimierten Bedingungen bis zu 15 mg l-1 h-1 Nootkatol und (+)-Nootkaton produziert werden. Das Substrat- und Produktspektrum von CYP109B1 wurde analysiert: Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Oxidation „linearer“ Substrate, wie zum Beispiel von Fettsäuren oder n-Alkoholen, durch CYP109B1 nicht regioselektiv verläuft. Allerdings zeigt CYP109B1 hohe Regio- und Chemoselektivität für die Oxifunktionalisierung allylischer Kohlenstoffatome von cyclischen Terpenen und Terpenoiden: So wurden α- und β-Ionon mit 100%iger Selektivität zu 3-Hydroxy-α-Ionon bzw. 4-Hydroxy-β-Ionon oxidiert. 4-Hydroxy-β-Ionon ist ein wichtiger Baustein für die Synthese von Carotinoiden und dem Phytohormon Abscisinsäure. Ein weiteres P450 mit Potential für biotechnologische Anwendung das im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde ist CYP152A2 – eine Peroxygenase aus dem anaeroben Bakterium C. acetobutylicum. Die Analyse des Substratspektrums ergab, dass CYP152A2 die Oxidation von gesättigten Fettsäuren selektiv am α- oder β-Kohlenstoffatom der Alkylkette katalysiert. Derart hydroxylierte Produkte finden unter anderem Anwendung bei der Herstellung von Surfactin-Antibiotika. Ferner wurde gezeigt, dass CYP152A2 auch mit Wasserstoffperoxid katalytisch aktiv ist und somit nicht notwendigerweise Redoxproteine für die Übertragung von Elektronen benötigt. Durch den Einsatz hoher Konzentrationen von Wasserstoffperoxid konnten Reaktionsraten von bis zu 200 min-1 erreicht werden, jedoch wurde das Enzym unter diesen Bedingungen binnen weniger Minuten inaktiviert. Kamen Redoxproteine für die Biokatalyse mit CYP152A2 zum Einsatz, wurden niedrigere Reaktionsraten gemessen, allerdings wurde aufgrund einer höheren P450-Stabilität die Effizienz des Systems insgesamt verbessert und somit bis zu 40-fach höhere Substratumsätze erreicht. Durch die Verwendung von nicht-physiologischen Redoxpartnern für die Biokatalyse mit CYP109B1 und CYP152A2 kam es zu Limitierungen der katalysierten Reaktionen durch die Entkopplung von NAD(P)H-Verbrauch und Substratoxidation. Daher wurden potentielle physiologische Redoxpartner für beide P450 identifiziert, die bis zu sechsfach höhere Kopplung gegenüber den zuvor verwendeten nicht-physiologischen Redoxpartnern zeigten. Hierdurch konnte die biokatalytische Aktivität von CYP152A2 und CYP109B1 deutlich gesteigert werden.Cytochrome P450 enzymes (P450 or CYP) are heme b containing monooxygenases that introduce one atom of molecular oxygen into a vast range of compounds and catalyze a broad spectrum of reactions, where chemical catalysts often fail. Oxidations by P450s require the consecutive delivery of two electrons derived from the pyridine cofactors NAD(P)H and transferred to the heme iron via external redox proteins (reductases and flavodoxins or ferredoxins). The biotechnological potential of P450s was recognized many years ago; however, the characterization and exploitation of newly-discovered P450 sequences is hampered by two major limitations: 1) The need for suitable electron transfer partners mandatory for P450 activity and for efficient biocatalysis, and 2) the unknown physiological function of most P450s meaning that there is no information available on potential substrates, which makes the selection of candidate P450s time- and labor-intensive. Within this study the screening of a recombinant P450 library comprising 242 bacterial and fungal P450s was accomplished. The aim was to identify and characterize novel P450s whose oxidizing activities lead to high-value fine-chemicals, especially for flavor and fragrance industries. One example was (+)-nootkatone, which is a sought-after fragrance naturally found in low amounts in grapefruit. Within the screening, CYP109B1 from Bacillus subtilis was found to produce (+)-nootkatone by oxidation of the precursor (+)-valencene via the intermediate nootkatol. A whole cell process with recombinant E. coli expressing CYP109B1 in a two-liquid phase system was designed and produced 15 mg l-1 h-1 of (+)-nootkatone and nootkatol under optimized conditions. Further, the substrate and product spectrum of CYP109B1 was analyzed: The enzyme is generally unselective for fatty acid oxidation, but shows high selectivity for allylic oxidation of cyclic terpenes and terpenoids, for example 100% for α- and β-ionone. A second P450 focused on within this study with potential for biotechnological application was CYP152A2 – a peroxygenase from the anaerobe bacterium Clostridium acetobutylicum. This P450 was found to catalyze fatty acid oxidation at α- and β-carbon atoms exclusively. Non-physiological redox proteins were used for activity reconstitution of both P450s in the first experiments, but were proven inefficient due to uncoupling between NAD(P)H consumption and substrate oxidation. Hence, physiological redox partners for both P450s were identified and characterized. Their application resulted in higher coupling (to some extend) and thus led to improved biocatalytic P450 activities. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.11.2010 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.11.2010 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.09.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.11.2010 |
