Dokument: Analyse der Modifikationen von CapG und ihre Bedeutung für die Metastasierung des Mammakarzinoms

Titel:	Analyse der Modifikationen von CapG und ihre Bedeutung für die Metastasierung des Mammakarzinoms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12204
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090722-071800-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Seier, Nicole [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,55 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.07.2009 / geändert 21.07.2009
Beitragende:	Prof. Dr. D'Haese, Jochen [Gutachter] Prof. Dr. Janni, Wolfgang [Gutachter]
Stichwörter:	CapG, Metastasierung, Mammakarzinom, Zellmobilität
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Überexpression des Actin-modulierenden Proteins CapG konnte bei einer Reihe von Karzinomen, u.a. beim Mammakarzinom, gezeigt werden. CapG ist sowohl ein cytoplasmatisches als auch ein nucleäres Protein. Untersuchungen an Macrophagen- und Nierenepithel-Zelllinien haben ergeben, dass neben einer Erhöhung der CapG-Expression offenbar auch die Lokalisation im Zellkern und eine Phosphorylierung von CapG für das metastatische Potential von Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurden im Wesentlichen Mammakarzinom-Zelllinien untersucht von denen 60% eine erhöhte CapG Expression aufwiesen. Als Maß für das metastatische Potential wurde ein Invasionsassay verwendet. Durch die Manipulation der CapG-Expression konnte das Invasionspotential zweier Zelllinien deutlich beeinflusst werden. (1) Die Invasivität der metastatisch aktiven Zelllinie (MDA-MB 231) wurde durch siRNA dosisabhängig reduziert. (2) Führte eine Überexpression von CapG bei der gering invasiven Zelllinie (BT-20), durch stabile Transfektion, zu einer deutlichen Steigerung der Invasivität. Der Anteil an nucleärem CapG bei den MDA-MB 231 Zellen lag bei über 50%. Die CapG-Überexpression führte bei der BT-20 zu einer ebenfalls hohen CapG-Menge im Zellkern. Nach einer zwei-dimensionalen elektrophoretischen Auftrennung cytoplasmatischer und nucleärer CapG-Varianten aus humanen Leukozyten, konnten insgesamt 11 deutliche Spots identifiziert werden. Dabei waren 10 Spots in Doppelspots, mit Unterschieden im isoelektrischen Punkt (IEP) von 0,06, angeordnet. Eine Hemmung der Phosphatasen und eine Phosphatase-Behandlung gaben erste Hinweise auf eine Phosphorylierung der saureren CapG-Spots. Durch massenspektrometrische Analysen zeigte sich, dass die CapG-Variante mit dem sauersten IEP, welche als einzige nicht als Doppelspot angeordnet war, eine Phosphorylierung an Serin337 aufweist. Es konnte hier erstmals gezeigt werden, dass die Bildung eines Doppelspots durch den Austausch von Arginin zu Histidin an der Position 335 zustande kommt. Der Austausch ist in einer, beim Menschen bereits beschriebenen, genetischen Varianz begründet. Durch den Austausch von Arginin zu Histidin wird das Erkennungsmotiv für die Phosphorylierung an Serin337 zerstört, wodurch es nur zu einer Phosphorylierung der Arginin-Variante an dieser Position kommt, was den fehlenden Doppelspot der letzten CapG-Variante erklärt. Eine weitere Phosphorylierungsstelle konnte durch massenspektrometrische Analysen nicht identifiziert werden. Durch Aminosäureaustausch konnten jedoch sieben potentielle Phosphorylierungsstellen ausgeschlossen werden. Die Unterdrückung der Phosphorylierung an Serin337 (CapGMut337) führte nicht zu einer unterschiedlichen subzellulären Verteilung des CapG-Proteins. MDA-MB 231 Zellen, die nach stabiler Expression nur die Histidin- oder CapGMut337-Varianten exprimierten wiesen jedoch ein geringeres Invasionspotential auf, als die Transfektanten, die die Arginin-Varianten exprimierten. Bei den basischen Varianten von CapG konnte eine Abspaltung der ersten drei bzw. ersten sechs Aminosäuren und eine Pyroglutamatbildung massenspektrometrisch identifiziert werden. Diese Varianten wurden nicht im Zellkern detektiert, die anderen Varianten wiesen hingegen einen vergleichbaren nucleären und cytoplasmatischen Anteil auf, was auf eine Funktion des N-terminalen Bereichs von CapG bei der nucleären Translokation hindeutet. Das Fehlen von N-terminal verkürzten phosphorylierten CapG-Varianten führte zu der Annahme, dass die Abspaltung durch eine Phosphorylierung unterdrückt und damit die nucleäre Lokalisation von CapG begünstigt wird. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lassen vermuten, dass die N-terminale Verkürzung und die unterschiedliche Phosphorylierung der Histidin- und Arginin-Varianten von CapG die nucleäre Translokation des Proteins bzw. das Invasionspotential einer Zellen beeinflussen. Overexpression of the actin-modulating protein CapG could be shown in a number of carcinomas e.g. in breast carcinomas. CapG is both, a cytoplasmic and nuclear localized protein. Analyses on macrophages- and kidney epithelial cell lines revealed that besides increased expression of CapG also its nuclear localisation is important for the metastatic potential of cells. Approximately 60% of the analysed breast carcinoma cell lines exhibits an increased expression level of CapG. To evaluate the metastatic potential of cells a Matrigel invasion assay was used. Manipulative alterations in CapG-expression considerably affected the invasive potential of two cell lines. (1) Invasiveness of the metastatic cell line (MDA-MB 231) was reduced by siRNA in a dose-dependent manner, (2) CapG-overexpression in stable transfectants of non invasive BT-20 cells results in an increase of invasive potential. The MDA-MB 231 exhibits more than 50% of CapG in the nucleus. CapG-overexpression in BT-20 CapG transfectants leads also to a high amount of nuclear CapG. After two-dimensional gel electrophoresis of cytoplasmic and nuclear CapG isolated from human leucocytes, eleven distinct spots could be identified. The pattern showed five double-spots with differences in their isoelectric points (pI) of 0,06, respectively. Both, inhibition of phosphatases activity and phosphatase-treatment indicate that acidic variants are caused by phosphorylation of CapG. The most acidic variant of CapG represented by a single spot is phosphorylated at serine337, as revealed by mass spectrometry. It could be shown for the first time that CapG variants oft the double-spots only vary in the amino acid at the position 335, an exchange from arginine to histidine due to a single-nucleotide polymorphism which has already been described in humans. Replacement of arginine results in a destruction of the consensus sequence for serine337-phosphorylation, explaining this single spot due to the exclusive phosphorylation of the CapG-arginine337 variant. Comprehensive analyses by mass spectrometry failed to identify another phosphorylation site. By mutation analyses seven potential phosphorylation sites were excluded. Inhibition of serine337 phosphorylation (CapGMut337) revealed that this modification doesn’t affect intracellular distribution of CapG-protein. However MDA-MB 231 cells expressing the histidine- or CapGMut337-variants exhibit a lower invasive potential compared to MDA-MB 231 cells, homozygous for the arginine-variant. Mass spectrometry analyses identified an N-terminal truncation of three or six amino acids and the formation of pyroglutamate of the most basic variants. In contrast to the other CapG-variants which show similar amounts of nuclear and cytoplasmic CapG, truncated variants were not detected in the nucleus indicating that N-terminus of CapG is involved in nuclear translocation. Furthermore N-terminal truncation was not seen in phosphorylated variants of CapG supporting the idea that phosphorylation preventing N-terminal truncation contributes to the nuclear localisation of CapG. The results of this study suggest that N-terminal truncation and the different phosphorylation of the CapG arginine- and histidine variants have an impact on nuclear translocation of the protein and the invasive potential of cells.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Zoomorphologie, Zellbiologie und Parasitologie
Dokument erstellt am:	22.07.2009
Dateien geändert am:	21.07.2009
Promotionsantrag am:	30.04.0009
Datum der Promotion:	05.06.0009