Dokument: Posttranslationale Regulation der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Posttranslationale Regulation der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Posttranslational regulation of 2-oxoglutarate dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10107
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090122-093713-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biologe Schultz, Christian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,70 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.01.2009 / geändert 12.01.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Beitragender] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Beitragender]
Stichwörter:	Corynebacterium glutamicum, 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase, OdhI, Glutamat, Biotin, Tween-40, Penicillin G, Ethambutol, Serin/Threonin-Proteinkinase, Phospho-Serin/Threonin-Proteinphosphatase, PknA, PknB, PknG, PknL, Ppp, FtsZ, Icd
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Corynebacterium glutamicum wird industriell für die jährliche Produktion von ca. 1,5 Millionen Tonnen des Geschmacksverstärkers L-Glutamat eingesetzt. Bei diesem Prozess spielt die reduzierte Aktivität des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (ODH) eine wichtige Rolle. Vor kurzem konnte in unserer Arbeitsgruppe ein neuartiger Mechanismus zur posttranslationalen Regulation der ODH-Aktivität identifiziert werden. Das 15-kDa OdhI-Protein bindet im unphosphorylierten Zustand mit hoher Affinität an OdhA, die E1-Untereinheit von ODH, und inhibiert die Aktivität des Komplexes. Durch Phosphorylierung von OdhI an Threonin-14 durch die Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknG wird die Bindung an OdhA und damit die Hemmung der ODH-Aktivität verhindert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Frage untersucht, welche Bedeutung der neue ODH-Regulationsmechanismus für die Glutamat-Produktion hat. Dazu wurde die Glutamat-Bildung des Wildtyps und verschiedener Deletionsmutanten unter vier verschiedenen Bedingungen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie die Glutamat-Exkretion induzieren: Biotin-Mangel, Zugabe von Penicillin G, Zugabe von Tween-40 und Zugabe von Ethambutol. Eine ΔodhI-Mutante bildete unter allen getesteten Bedingungen nur noch 1 – 13 % der Glutamat-Konzentration des Wildtyps. Dieser Defekt konnte durch Komplementation der ΔodhI-Mutante mit einem odhI-Expressionsplasmid größtenteils wieder aufgehoben werden. Somit ist die Anwesenheit des OdhI-Proteins essentiell für eine effiziente Glutamat-Produktion. Bei der Analyse einer ΔpknG-Mutante war unter starker Biotin-Limitierung und bei Zugabe von Ethambutol eine deutlich gesteigerte Glutamat-Produktion im Vergleich zum Wildtyp zu beobachten, bei Zugabe von Tween-40 dagegen nicht. Penicillin G führte zu schlechterem Wachstum der ΔpknG-Mutante, aber einer erhöhten spezifischen Glutamat-Produktivität. Im Fall der ΔpknG-Mutante ist also der Effekt auf die Glutamat-Bildung abhängig von den Induktionsbedingungen. Zur in-vivo-Analyse des OdhI-Phosphorylierungsstatus wurde in dieser Arbeit ein Western-Blot-Assay etabliert, der eine Unterscheidung und halbquantitative Analyse von phosphoryliertem und unphosphoryliertem OdhI erlaubt. Mit Hilfe dieses Assays konnte gezeigt werden, dass insbesondere die Biotin-Limitierung zu einer verstärkten Dephosphorylierung des OdhI-Proteins führt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Dephosphorylierung von OdhI in einer Mutante gehemmt ist, der das Gen ppp für die einzige in C. glutamicum annotierte Phospho-Ser/Thr-Proteinphosphatase fehlt. Somit konnte Ppp als die für die Dephosphorylierung von OdhI verantwortliche Phosphatase identifiziert werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass OdhI auch in einer ΔpknG-Mutante noch teilweise phosphoryliert vorliegt. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde daher der Frage nachgegangen, welche STPKs außer PknG an der Phosphorylierung von OdhI beteiligt sind. Dazu wurde ein Satz von weiteren Mutanten konstruiert, in denen die vier STPK-Gene einzeln oder in Kombination deletiert wurden. Die Tatsache, dass die Mutanten ΔpknA, ΔpknB, ΔpknL, ΔpknAΔpknG, ΔpknBΔpknG, ΔpknLΔpknG, ΔpknAΔpknL, ΔpknBΔpknL, ΔpknAΔpknLΔpknG und ΔpknBΔpknLΔpknG erhalten wurden, zeigt, dass keine der vier STPKs für C. glutamicum essentiell ist. Die einzige Kombination, die letal zu sein scheint, ist eine gemeinsame Deletion von pknA und pknB. Western-Blot-Analysen mit den Mutanten ergaben, dass bei Wachstum in BHI-Medium mit Glucose neben PknG primär PknA für die Phosphorylierung von OdhI verantwortlich ist, dass aber auch PknB und PknL geringfügig zur OdhI-Phosphorylierung beitragen. Diese in-vivo-Untersuchungen wurden durch in-vitro-Experimente unterstützt, die zeigten, dass die isolierten Kinasedomänen von PknA, PknB und PknL gereinigtes OdhI-Protein phosphorylieren. Dabei konnten mittels massenspektrometrischer Analysen Threonin-15 und Serin-46 als weitere Phosphorylierungsstellen im OdhI-Protein identifiziert werden. In einem vierten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Deletion der verschiedenen STPK-Gene auf die Ethambutol-induzierte Glutamat-Bildung auswirkt. Es zeigte sich, dass die Mutanten ΔpknA, ΔpknAΔpknG, ΔpknAΔpknLΔpknG und ΔpknBΔpknLΔpknG eine ähnlich gesteigerte Glutamat-Bildung aufwiesen wie die ΔpknG-Mutante, während die ΔpknB- und die ΔpknL-Mutante nach 48 h gar kein Glutamat gebildet hatten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vier STPKs sehr unterschiedliche Einflüsse auf die Glutamat-Produktion haben, deren molekulare Ursachen bisher noch völlig unklar sind. In einem fünften Teil der Arbeit wurden die in die Zellteilung involvierte GTPase FtsZ und das Tricarbonsäurezyklus-Enzym Isocitrat-Dehydrogenase als weitere in-vitro-Substrate für STPKs und FtsZ zusätzlich als in-vivo-Substrat für die Phosphatase Ppp in C. glutamicum identifiziert. Während im Fall von FtsZ eine Reihe von Phosphopeptiden sowie eine Phosphorylierungsstelle bestimmt werden konnten, gelang dies bei der Isocitrat-Dehydrogenase noch nicht. Ebenso ist bisher der physiologische Einfluss der Phosphorylierung auf die Aktivitäten von FtsZ und Isocitrat-Dehydrogenase noch nicht bekannt. Corynebacterium glutamicum is industrially used for the annual production of about 1.5 million tons of the flavour enhancer L-glutamate. In this process the reduced activity of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex (ODH) plays a decisive role. Recently, a novel mechanism for posttranslational regulation of ODH activity was identified in our working group. The 15-kDa OdhI protein binds in its unphosphorylated state with high affinity to OdhA, the E1 subunit of ODH, and inhibits the activity of the complex. Phosphorylation of OdhI at threonine-14 by the serine/threonine protein kinase (STPK) PknG prevents binding to OdhA and therefore inhibition of ODH activity. In the first part of this work the role of this novel regulatory mechanism in glutamate production was investigated. For this purpose, glutamate formation of the wild type and different deletion mutants was investigated under four different conditions, which are known to induce glutamate excretion: biotin limitation, addition of penicillin G, addition of Tween-40 and addition of ethambutol. A ΔodhI mutant formed only 1 – 13 % of the glutamate concentration of the wild type under all tested conditions. This defect was abolished by complementation of the ∆odhI mutant with an odhI expression plasmid. Consequently, the presence of OdhI protein is essential for an efficient glutamate production. Analysis of a ∆pknG mutant revealed a significantly increased glutamate production under strong biotin limitation and after addition of ethambutol, but not after addition of Tween-40. Penicillin G resulted in decreased growth of the ∆pknG mutant but led to an increased specific glutamate productivity. Thus, influence of a pknG deletion on glutamate formation depends on the induction conditions. A Western blot assay for the in vivo analysis of the OdhI phosphorylation status was established in this work allowing differentiation and semiquantitative analysis of phosphorylated and unphosphorylated OdhI. It was shown by this assay that particularly biotin limitation leads to an increased dephosphorylation of the OdhI protein. In addition, it was shown that dephosphorylation of OdhI is inhibited in a mutant lacking the gene ppp for the only annotated phospho-serine/threonine protein phosphatase of C. glutamicum. Therefore, Ppp was identified as the phosphatase responsible for the dephosphorylation of OdhI. Former analyses had shown that OdhI is still partially phosphorylated in a ∆pknG mutant. Therefore, in a third part of this work the question was analysed, which STPKs besides PknG are involved in the phosphorylation of OdhI. For this purpose, a set of further mutants was constructed in which the four STPK genes were deleted either individually or in combination. The fact that the mutants ∆pknA, ∆pknB, ∆pknL, ∆pknA∆pknG, ∆pknB∆pknG, ∆pknL∆pknG, ∆pknA∆pknL, ∆pknB∆pknL, ∆pknA∆pknL∆pknG and ∆pknB∆pknL∆pknG could be obtained shows that none of the four STPKs is essential in C. glutamicum. The only combination which seems to be lethal is the combined deletion of pknA and pknB. Western blot analyses with these mutants after growth in BHI medium with glucose revealed that PknA is primary responsible for the phosphorylation of OdhI besides PknG, but PknB and PknL also contribute marginally to OdhI phosphorylation. These in vivo analyses were supported by in vitro experiments which showed that the isolated kinase domains of PknA, PknB and PknL phosphorylated the OdhI protein. Threonine-15 and serine-46 were identified as additional phosphorylation sites within the OdhI protein by mass spectrometric analyses. In a fourth part of this work it was analyzed how the deletion of the different STPK genes affects ethambutol-induced glutamate formation. It was shown that the mutants ∆pknA, ∆pknA∆pknG, ∆pknA∆pknL∆pknG and ∆pknB∆pknL∆pknG revealed a similarly increased glutamate formation as the ∆pknG mutant, whereas the ∆pknB and the ∆pknL mutant formed no glutamate after 48 h. These results demonstrate that the four STPKs have very different influences on glutamate production, molecular basis of which is completely unclear so far. In a fifth part of the work the GTPase FtsZ, which is involved in cell division, and the tricarboxylic acid cycle enzyme isocitrate dehydrogenase were identified as additional in vitro substrates of STPKs and FtsZ additionally as in vivo substrate of the phosphatase Ppp in C. glutamicum. In the case of FtsZ several phosphopeptides as well as one phosphorylation site were identified, whereas this was not possible for isocitrate dehydrogenase up to now. Moreover, the physiological effects of the phosphorylation on the activities of FtsZ and isocitrate dehydrogenase are still unknown.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.01.2009
Dateien geändert am:	12.01.2009
Promotionsantrag am:	21.11.2008
Datum der Promotion:	17.12.2008