Dokument: DNA damage by respiratory quartz particle in rat lung epithelial cells: mechanisms and consequences in vitro

Titel:	DNA damage by respiratory quartz particle in rat lung epithelial cells: mechanisms and consequences in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3631
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070221-112635-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Li, Hui [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 792 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Kahl, Regine [Gutachter] Prof. Dr. Borm, Paul [Gutachter] Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter]
Stichwörter:	respirabler Quarzpartikel DQ12, pulmonaler Fibrose und Lungentumoren , reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies , DNA Schäden, epithelialen Typ-II-Zellen der Rattenlunge (RLE), 8-Hydroxy-Deoxyguanosin (8-OHdG), Funktionen der mitochondralen Elektronentransportkette, Curcumin, entzündlichen Effekten, Formamidopyrimidin-Glykosylase (FPG)-modifiziertem Kometassayrespirable quartz particles DQ12, pulmonary fibrosis and lung cancer, reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS), DNA damage, rat lung epithelial type II cells (RLE), 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), mitochondrial electron transport chain function, Curcumin, inflammatory effect , formamidopyrimidine glycosylase (FPG)-modified comet assay
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die chronische Inhalation hoher Konzentrationen respirabler Quarzpartikel wird mit verschiedenen Lungenerkrankungen einschließlich pulmonaler Fibrose und Lungentumoren in Verbindung gebracht. Die Generierung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (engl.: reactive oxygen species, ROS; reactive nitrogen species, RNS) und oxidativem Stress werden als Hauptaspekt bei der Toxizität von Quarzpartikeln diskutiert. Dennoch wurden die Mechanismen, die in die quarzinduzierte Karzinogenese involviert sind, bislang nur teilweise aufgeklärt. Beides, sowohl primäre als auch sekundäre Gentoxizität werden als Möglichkeiten für quarzinduzierte Lungentumoren betrachtet. Primäre Genotoxizität wird als genetische Schädigung durch die Partikel selbst – entweder direkt oder indirekt – definiert. Dagegen wird als sekundäre Genotoxizität eine genetische Schädigung bezeichnet, die durch ROS/RNS (oder mögliche andere Mediatoren) während einer partikelinduzierten Entzündungsantwort verursacht wird. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der indirekten Induktion von primären DNA Schäden durch die respirablen Standardquarzpartikel DQ12 in epithelialen Typ-II-Zellen der Rattenlunge (RLE) untersucht. Transmissionselektronenmikroskopie und flowzytometrische Analysen zeigten eine schnelle Aufnahme (30 min bis 4 h) der Quarzpartikel in RLE-Zellen, jedoch wurden keine Partikel im Zellkern nachgewiesen. Dies weist darauf hin, dass die Induktion von DNA-Strandbrüchen und 8-Hydroxy-Deoxyguanosin (8-OHdG), die ebenfalls in den Zellen nach Quarzbelastung innerhalb gleicher Intervalle auftraten, nicht aus der direkten physischen Interaktion von Partikeln mit der DNA oder kurzlebiger ROS der Partikeloberfläche resultierte. Die quarzinduzierte DNA-Schädigung wurde in Gegenwart der mitochondrialen Inhibitoren Rotenon und Aktinomyzin A signifikant reduziert. In Abwesenheit von Quarz beeinflussten diese Inhibitoren die DNA-Schädigung nicht, sie reduzierten jedoch den zellulären Sauerstoffverbrauch. Bis zu 4 h nach der Quarzbelastung wurden keine Merkmale der Induktion von Apoptose beobachtet. Flowzytometrische Untersuchungen zeigten, dass die reduzierten DNA-Schäden in Gegenwart von Rotenon nicht durch eine mögliche verminderte zelluläre Partikelaufnahme verursacht wurden. Ein weiterer Beweis für die Rolle der Mitochondrien wurde mit dem Fehlen quarzinduzierter DNA-Schäden in Osteosarkomzellen mit verminderter Mitochondrienanzahl 143B (rho-0) bei Quarzkonzentrationen gezeigt, die in der parentalen 143B-Zelllinie DNA-Schäden induzierten. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass respirable Quarzpartikel ohne Präsenz im Zellkern oxidative DNA-Schäden in Typ-II-Lungenepithelzellen induzieren, einem Zelltyp der in der quarzinduzierten Karzinogenese als bedeutende Zielzelle angesehen wird. Weiterhin weisen die Untersuchungen darauf hin, dass in solche indirekten DNA-Schädigungen Funktionen der mitochondralen Elektronentransportkette involviert sind, wobei die hierfür verantwortlichen Mechanismen noch zu klären sind. Im zweiten Teil der Dissertation wurde das Antioxidans Curcumin hinsichtlich seiner Kapazität, Lungenepithelzellen vor quarzinduzierten gentoxischen und entzündlichen Effekten zu schützen, untersucht. Experimente mittels Elektronen-Paramagnetischer Resonanz unter Nutzung des Spintraps DMPO zeigten, dass Curcumin die Wasserstoffperoxid-abhängige Hydroxylradikal-Formation durch Quarz reduziert. In Verbindung mit diesen Ergebnissen wurde auch demonstriert, dass Curcumin die quarzinduzierte Zelltoxizität in RLE-Zellen vermindert. Des weiteren inhibiert Curcumin die Ausschüttung des Makrophagen-inflammatorischen Proteins-2 (MIP-2) von RLE-Zellen, die nach Behandlung mit den proinflammatorischen Zytokinen Interleukin-1 beta (IL-1β) und Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNFα) beobachtet wurde. DQ12 verursacht einen Anstieg der oxidativen DNA-Schädigung in RLE-Zellen, der sowohl mittels Formamidopyrimidin-Glykosylase (FPG)-modifiziertem Kometassay als auch durch immunozytochemische Analysen von 8-OHdG nachgewiesen wurde. Die Vorbehandlung mit Curcumin verhinderte jedoch die quarzinduzierte DNA-Schädigung nicht, im Gegenteil, Curcumin selbst verursachte bei nicht-zytotoxischen und nicht-inflammatorischen Dosen eine starke DNA-Schädigung. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der Dissertation darauf hin, dass Mitochondrien bedeutende Mediatoren quarzinduzierter DNA-Schäden sind. Dies unterstützt die Hypothese einer alternativen Induktion von Gentoxizität, wobei DNA-Schäden durch Partikel induziert werden, ohne dass diese selbst in den Zellkern gelangen. Weitere Untersuchungen hinsichtlich der detaillierten Mechanismen der mitochondrialen Funktion nach Partikelaufnahme sind jedoch erforderlich. Insbesondere sollte bei der Risikoabschätzung von Partikeln berücksichtigt werden, dass diese auch - unabhängig von ihrer Präsenz im Zellkern - gentoxische Wirkungen haben können. Ob dies auch eine Rolle bei der Induktion quarzbedingter Tumoren spielt, sollte in weiteren Studien untersucht werden. Hinsichtlich solcher Studien zeigen die Daten mit Curcumin als Antioxidanz, dass in vitro Ergebnisse nicht ohne weiteres auf in vivo Anwendungen übertragen werden können. Ursachen für die Differenzen zwischen azellulären und zellulären Effekten von Curcumin bleiben weiterhin zu untersuchen, Ursache könnte jedoch die Bildung toxischer Metabolite im zellulären System sein. Chronic inhalation of high concentrations of respirable quartz particles has been associated with various lung diseases including pulmonary fibrosis and lung cancer. Generation of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) and oxidative stress have been implicated as a major aspect of the toxicity of quartz. Nevertheless, the mechanisms involved in carcinogenesis by quartz exposure have been only partly elucidated. Both primary and secondary genotoxicity have been discussed as pathways of quartz induced lung cancer. Primary genotoxicity is defined as genetic damage elicited by the particle itself (either direct or indirect), whereas secondary genotoxicity is defined as the genetic damage resulting from ROS/RNS (and possibly other mediators) that are generated during particle-elicited inflammation. In the first part of the thesis, the mechanisms underlying the indirect pathways of primary DNA damage induced by respirable standard DQ12 quartz particles in rat lung epithelial type II cells (RLE) have been investigated. Transmission electron microscopy and flow-cytometry analysis showed a rapid uptake (30 minutes to 4 hours) of quartz particles by the RLE cells, but particles were not found to translocate into cell nuclei. This indicates that the DNA strand breakage and induction of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) which is also observed in these cells during these treatment intervals- did not result from direct physical interactions between particles and the DNA, or from short-lived particle surface-derived ROS. DNA damage caused by quartz was significantly reduced in the presence of the mitochondrial inhibitors rotenone and antimycin-A. In the absence of quartz, these inhibitors did not affect DNA damage, but they reduced cellular oxygen consumption. No signs of apoptosis were observed up to 4 h after quartz treatment. Flow-cytometric analysis indicated that the reduced DNA damage by rotenone was not due to a possible mitochondria-mediated reduction of particle uptake by the RLE cells. Further proof for the role of mitochondria was shown by the failure of quartz to cause DNA damage in mitochondria-depleted 143B (rho-0) osteosarcoma cells, at concentrations where it elicited DNA damage in the parental 143B cell line. In conclusion, our data show that respirable quartz particles can elicit oxidative DNA damage without entering the nuclei of lung epithelial type II cells, which are considered to be important target cells in quartz carcinogenesis. Furthermore, our observations indicate that such indirect DNA damage involves the mitochondrial electron transport chain function, by an as-yet-to-be elucidated mechanism. In the second part of this thesis, the antioxidant Curcumin was used to investigate its capacity to protect lung epithelial cells from the genotoxic and inflammatory effects associated with quartz exposure. Electron paramagnetic resonance measurements using the spin-trap DMPO demonstrated that curcumin reduces hydrogen peroxide-dependent hydroxyl-radical formation by quartz. In association with these observations, curcumin was found to reduce quartz-induced cytotoxicity in rat lung epithelial cells. Curcumin also inhibited the release of macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) from RLE cells as observed upon treatment with the pro-inflammatory cytokines interleukin-1 beta (IL-1β) and Tumour Necrosis Factor-alpha (TNFα). DQ12 caused an increase in oxidative DNA damage in the RLE cells as determined by formamidopyrimidine glycosylase (FPG)-modified comet assay as well as by immunocytochemical analysis of 8-OHdG. However, curcumin failed to protect the RLE cells from oxidative DNA damage by quartz, instead it was found to be a strong inducer of oxidative DNA damage itself at non-cytotoxic and anti-inflammatory concentrations. In summary, the findings in this thesis suggest that mitochondria are important mediators of quartz induced DNA-damage. These data provide an alternative pathway of genotoxicity caused by quartz whereby DNA damage is induced by particles without entering into the nucleus. Though further investigations are needed on detailed mechanisms of mitochondrial function after particle uptake, it indicates that consideration should be taken in particle risk assessment i.e. that particles may still be genotoxic despite their absence in the nucleus. Whether this plays a role in vivo in lung cancer induced by silica, remains to be studied. With regard to such studies, the data with curcumin as an antioxidant intervention show that in vitro data cannot be simply converted into in vivo applications. The reasons for the difference between acellular and cellular effects of curcumin remain to be elucidated, but could be associated with metabolic conversion products that are formed in cellular incubations.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	29.01.2007
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	23.01.2007
Datum der Promotion:	23.01.2007