Fabrication and characterization of microstructured scaffolds for complex 3D cell cultures

In einem natürlichen Gewebe wird das zelluläre Verhalten durch Stimuli der Mikroumgebung reguliert. Verschiedene chemische, mechanische und physikalische Reize befinden sich in einem lokalen Milieu und versorgen die Zellen mit einem biologischen Kontext. Im Vergleich zur in vivo Situation, zeigen Standard 2D in vitro Zellkulturmodelle viele Unterschiede in der zellulären Mikroumgebung und können infolgedessen eine Veränderung der Zellantwort verursachen. Die Schaffung einer physiologisch realistischeren Umgebung auf künstlichem Substrat ist ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung zuverlässiger Plattformen, die es den kultivierten Zellen ermöglichen, sich natürlicher zu verhalten. Daher sind neuartige Substrate auf Biomaterialbasis mit maßgeschneiderten Eigenschaften sehr gefragt.
Die Mikrotechnik ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das bei der Herstellung der Funktionsgerüste hilft, um verschiedene Eigenschaften der in vivo Umgebung zu reproduzieren und auf in vitro Bedingungen zu übertragen. Die Gerüstkonstruktionsparameter können manipuliert werden, um die für das jeweilige Gewebe spezifischen Anforderungen zu erfüllen. Eine der grundlegenden Einschränkungen bei aktuellen Herstellungsverfahren ist jedoch die Unfähigkeit, mehrere Gerüsteigenschaften auf vorgefertigte Weise in eine einzelne Gerüststruktur zu integrieren.
Diese Dissertation befasst sich mit Gerüstmikrofabrikations- und Oberflächenmodifikations-techniken, welche die Mikrostrukturierungstechnologie verwenden und die gleichzeitige Kontrolle über verschiedene Gerüsteigenschaften ermöglichen. Diese Ansätze bei der Mikrofabrikation von Polymergerüsten werden verwendet, um physikalische und chemische Eigenschaften bereitzustellen, die für die Leberzellkultur optimiert sind. Die physikochemischen Aspekte, die die zelluläre Mikroumgebung von Lebergewebe in vivo ausmachen, werden diskutiert und anschließend werden relevante Technologien vorgestellt, mit denen einige dieser Aspekte in vitro reguliert werden können.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein neuartiges zweistufiges Verfahren zur Herstellung von Polymergerüsten mit mikroporöser Struktur und definierter Topographie gezeigt. Um 3D-Matrizen mit integrierter Porosität zu erhalten, wurde nach der Herstellung mikroporöser Folien ein Mikrostrukturierungsprozess unter Verwendung der Mehrschicht Polymer-Thermoformtechnologie durchgeführt. Diese Methoden wurden verwendet, um Substrate für die organotypische 3D-Hepatozytenkultivierung herzustellen. Poröse Gerüste mit Mikrokavitäten wurden aus lösungsmittelgegossenen und phasengetrennten Polymilchsäure (PLA) Folien gebildet. Die Proben wurden auf grundlegende mechanische und Oberflächenspezifische Eigenschaften sowie auf die Zellleistung untersucht. Um einen Bezugspunkt für die Bewertung der hergestellten Matrices bereitzustellen, wurden PLA-Gerüste mit zuvor beschriebenen Substraten auf Polycarbonat (PC)-Basis mit ähnlicher Geometrie verglichen. HepG2-Zellen, die in PLA-Gerüsten kultiviert wurden, zeigten eine gewebeartige 3D-Aggregation und eine erhöhte Sekretionsrate von Albumin im Vergleich zu PC-Gerüsten. Anschließend wurde dieses zweistufige Herstellungsverfahren verwendet, um schnell abbaubare Gerüste für die gerüstfreie Zellblatttechnik herzustellen. Gerüste mit kontrollierter Porosität und Topographie, die die Schlüsselmerkmale von Lebersinusoiden nachahmen, wurden aus Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA)-Copolymer hergestellt und für den in vitro Abbau in Zellkultur charakterisiert. Um die Beziehung zwischen dem Abbau des Gerüsts und der Organisation der Zellen in der PLGA-Matrix aufzudecken, wurde die Lebensfähigkeit und Morphologie der kultivierten Zellen zusammen mit der Morphologie des Gerüsts untersucht.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden verschiedene technische Lösungen für die gerichtete Strukturierung mikroporöser Polymergerüste bewertet und ihre Eignung zur Erzeugung einer benutzerdefinierten lebenswichtigen oligozellulären Morphologie auf künstlichem Substrat vorgestellt. Besonderes Augenmerk wurde auf das 3D-Mikrokontaktdruckverfahren (3DµCP) gelegt, das die Vorteile des Mikrothermoformens und des Mikrokontaktdrucks kombiniert und eine räumlich-zeitliche Kontrolle über morphologische und chemische Merkmale in einem einzigen Schritt ermöglicht. Um das Potenzial dieser Technik aufzuzeigen, wurden Gerüste mit bestimmten Mikrostrukturen wie Kanäle mit verschiedenen Tiefen und Breiten sowie komplexere Muster hergestellt und verschiedene ECM-Moleküle gleichzeitig in die vordefinierten Geometrien übertragen. Die Gültigkeit des 3DµCP-Prozesses wurde durch mikroskopische Messungen, Fluoreszenzfärbung und Testen der Substrate auf Zelladhäsionsantwort gezeigt.
Schließlich wird in dieser Arbeit die Herstellungsmethode zur Erzeugung komplexer Gerüste für die 3D- und gesteuerte Co-Kultivierung von Leberzellen vorgestellt. Polymermatrizen, die die grundlegende Leberarchitektur replizieren und somit eine gut organisierte Leberzellzusammensetzung ermöglichen, wurden erfolgreich unter Verwendung der 3DµCP-Methode hergestellt. Auf der Polycarbonatoberfläche wurden gleichzeitig chemische und topografische Leitfäden in Form sinusförmiger Strukturen strukturiert. Um die 3D-Gewebemikrostruktur zu replizieren, wurden EA.hy926- und HepG2-Zellen auf beiden Seiten des strukturierten porösen Gerüsts Co-kultiviert und anschließend einander gegenüber gestapelt, wodurch zugehörige Kanäle zur Bildung einer Kapillare führen. Das Potenzial unseres 3DµCP-strukturierten Gerüsts für die gerichtete Co-Kultivierung von Zellen wurde unter statischen Zellkulturbedingungen demonstriert. Am Ende wurden Gerüste für die weiteren Anwendungen im perfundierten Bioreaktorsystem angepasst.

In a natural tissue, cellular behavior is regulated by microenvironmental stimuli. Different chemical, mechanical and physical cues reside in a local milieu and provide cells with a biological context. Compare to the in vivo situation, standard 2D in vitro cell culture models show many differences in the cellular microenvironment and as a consequence can cause alteration in cellular response. Creating physiologically more realistic environment on artificial substrate is a key factor for development of reliable platforms that enables the cultured cells to behave in a more natural manner. Therefore, novel biomaterial-based substrates with tailored properties are highly demanded.
Microtechnology is a powerful tool that helps in the production of the functional scaffolds for reproducing various characteristics of the in vivo environment and transfer them to in vitro conditions. Scaffold design parameters can be manipulated to meet the needs specific to given tissue. However, one of the fundamental limitations in current fabrication methods is the inability to integrate multiple scaffold characteristics within a single scaffold structure in a pre-designed manner.
This dissertation discusses scaffold microfabrication and surface modification techniques that use microstructuring technology and allows simultaneous control over various scaffold properties. These approaches in microfabricating polymeric scaffolds are used to provide physical and chemical characteristic those are more optimal for liver cell culture. The physiochemical aspects that constitute the in vivo cellular microenvironment of liver tissue are discussed and subsequently relevant technologies that can be used to regulate some of those aspects in vitro are presented.
In the first part this thesis demonstrates a novel two-step procedure for manufacturing polymeric scaffolds with microporous structure and defined topography. To achieve 3D matrixes with integrated porosity, fabrication of microporous foils was followed by microstructuring process using multilayer polymer thermoforming technology. These methods were used to produce substrates for organotypic 3D hepatocyte cultivation. Porous scaffolds with the structure of microcavities were formed from solvent casted and phase separated polylactic acid (PLA) foils. Samples were investigated for basic mechanical and surface properties as well as cellular performance. Moreover, to provide a reference point for the evaluation of produced matrixes, PLA scaffolds were compared to previously reported polycarbonate (PC) based substrates with similar geometry. HepG2 cells cultured within PLA scaffolds showed 3D tissue-like aggregation and enhanced secretion rate of albumin in comparison to PC scaffolds. Subsequently, this two-step fabrication method was used to produce fast degradable scaffolds for scaffold-free cell sheet engineering. Scaffolds with controlled porosity and topography mimicking the key features of liver sinusoids were produced from poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) copolymer and characterized for in vitro degradation in cell culture. To reveal the relationship between degradation of the scaffold and organization of the cells in PLGA matrix, viability and morphology of the cultured cells was examined along with scaffolds morphology.
In the second part of this work, various technical solutions for directed patterning of microporous polymer scaffolds were evaluated and their suitability for creating a user-defined vital oligocellular morphology on artificial substrate was presented. Special attention was given to the 3D microcontact printing (3DµCP) method that combines the advantages of microthermoforming and microcontact printing and provides spatiotemporal control over morphological and chemical feature in a single step. To show the potential of this technique, scaffolds with determined microstructures like channels with various depths and widths as well as more complex patterns were fabricated and different ECM molecules were simultaneously transferred inside the predesigned geometries. The validity of 3DµCP process has been demonstrated by microscopic measurements, fluorescence staining and testing the substrates to cell adhesion response.
Finally, this thesis presents fabrication method for manufacturing complex scaffolds for 3D and guided co-cultivation of liver cells. Polymer matrixes that replicate basic liver architecture and thus facilitate well-organized hepatic cell composition were successfully produced using the 3DµCP method. Chemical and topographical guidance cues in the form of sinusoidal structures were simultaneously patterned on the polycarbonate surface. To replicate 3D tissue microstructure, EA.hy926 and HepG2 cells were co-cultured on both sides of the patterned porous scaffold and subsequently stacked facing each other by virtue of which associated channels results in the formation of a capillary. The potential of our 3DµCP patterned scaffold for directed co-cultivation of cells was demonstrated under static cell culture conditions. At the end, scaffolds were adapted for the further applications in perfused bioreactor system.

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