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Gonca Çetin

• Cellular protein homeostasis (proteostasis) maintains a functional proteome and thus proper cell function. Proteostasis is facilitated by the ubiquitin-proteasome system (UPS), an intracellular protein turnover machinery ensuring clearance of damaged, misfolded, old and/or unneeded regulatory proteins. This is particularly important in the central nervous system (CNS), where it is linked to neurodegeneration. Disruptions of the proteostasis systems cause the accumulation of misfolded proteins which are commonly seen in progressive neurodegenerative diseases also linked to neuroinflammation. Proper UPS function can protect cells from the accumulation of defective proteins, neurodegeneration and neuroinflammation. Furthermore, it has been found that loss of function mutations in the genes encoding UPS components are linked to systemic inflammation including neuroinflammation and/or neurodevelopmental disorders. Proteasome defects in patients suffering from these disorders cause decreased proteasome activity, accumulation of proteins, activation of proteotoxic stress responses and systemic inflammation. However, the molecular link between proteotoxic stress and the initiation of inflammatory signalling remained unclear. In Article 2, we summarized the importance of the UPS in immune cell proteostasis and function including activation of innate and adaptive immune responses. Although UPS function is notably important in innate immune signalling, the current understanding of the role of UPS in myeloid cell function in the CNS is limited. We also indicated the involvement of impaired UPS function in sterile systemic inflammation including neuroinflammation as well as tumour diseases and pathogen manipulation of immune cells. To investigate the molecular link behind proteasome impairment and systemic inflammation in the brain, we focused on microglia cells as the only immune residents of the CNS. In Article 1, we used a pharmacological inhibitor called bortezomib which targets β5 and β5i/LMP7 subunit activities in standard proteasome (SP) and immunoproteasome (IP), respectively. We showed for the first time on the molecular level that inhibition of proteasome activity by bortezomib triggers the accumulation of ubiquitylated proteins, proteotoxic stress responses and innate immune signalling activation depending on the induced proteotoxic stress response called unfolded protein response (UPR) in murine microglia. In particular, activation of the inositol-requiring protein 1α arm of UPR upon bortezomib treatment leads to systemic inflammation as indicated by type I interferon (IFN) response. IP enhance the proteolytic capacity of UPS by rapid clearance of proteins upon immune signalling activation. Microglia, like other immune cells, exhibit constitutive expression of IP as well as SP to maintain their cellular proteostasis. In Manuscript 3, we studied the particular impact of IP impairment on microglial cellular function. We showed accumulation of ubiquitin-modified proteins and activation of proteotoxic stress responses in IP-impaired mouse and human microglia models. Moreover, we identified possible IP substrates in microglia using β5i/LMP7 knockout mice as an IP deficiency model and, examined how IP deficiency affects microglia function. IP deficient microglia affected the ubiquitylation levels of proteins involved in multiple pathways such as immune responses, energy metabolism, cytoskeleton organisation, cell cycle and ribosome function. Based on the molecular analysis, we confirmed sterile activation of innate immune signalling mechanisms in IP impaired microglia. This is driven by the proteotoxic stress sensor protein kinase R (PKR). In addition, we were able to show that IP impairment altered levels of the microglial activation markers, which are also involved in motility, adhesion and phagocytosis of microglia. In this thesis, we highlight that UPS function is necessary to maintain microglial proteostasis and, that impairment of proteasome activities triggers sterile inflammation in microglia via activation of proteotoxic stress responses. The described activation of innate immune signalling mechanisms in microglia upon proteasome impairment may be considered as new therapeutic targets for patients suffering from rare protesomapathies or other disorders linked to dysregulated immune signalling.
• Die zelluläre Proteinhomöostase (Proteostase) erhält ein funktionsfähiges Proteom und damit eine ordnungsgemäße Zellfunktion aufrecht. Die Proteostase wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) erleichtert, eine intrazelluläre Proteinumsatzmaschinerie, die die Beseitigung beschädigter, falsch gefalteter, alter und/oder nicht benötigter regulatorischer Proteine gewährleistet. Dies ist besonders wichtig im Zentralnervensystem (ZNS), wo es mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht wird. Störungen des Proteostase-Systems verursachen die Anhäufung falsch gefalteter Proteine, die häufig bei fortschreitenden neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden, die auch mit Neuroinflammation in Verbindung stehen. Eine ordnungsgemäße UPS-Funktion kann Zellen vor der Ansammlung defekter Proteine, Neurodegeneration und Neuroinflammation schützen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Funktionsverlust-Mutationen in den Genen, die UPS-Komponenten codieren, mit systemischer Entzündung, einschließlich Neuroinflammation und/oder neurologischen Entwicklungsstörungen, verbunden sind. Proteasom-Defekte bei Patienten, die an diesen Störungen leiden, verursachen eine verringerte Proteasom-Aktivität, eine Akkumulation von Proteinen, eine Aktivierung von proteotoxischen Stressreaktionen und eine systemische Entzündung. Der molekulare Zusammenhang zwischen proteotoxischem Stress und der Initiierung von Entzündungssignalen blieb jedoch unklar. In Artikel 2 haben wir die Bedeutung des UPS für die Proteostase und Funktion von Immunzellen zusammengefasst, einschließlich der Aktivierung angeborener und adaptiver Immunantworten. Obwohl die UPS-Funktion bei der Signalübertragung des angeborenen Immunsystems besonders wichtig ist, ist das derzeitige Verständnis der Rolle des UPS bei der myeloischen Zellfunktion im ZNS begrenzt. Wir zeigten auch die Beteiligung einer gestörten UPS-Funktion an sterilen systemischen Entzündungen, einschließlich Neuroinflammation, sowie Tumorerkrankungen und Pathogenmanipulation von Immunzellen. Um die molekulare Verbindung hinter der Beeinträchtigung des Proteasoms und der systemischen Entzündung im Gehirn zu untersuchen, konzentrierten wir uns auf Mikrogliazellen als die einzigen Immunbewohner des ZNS. In Artikel 1 verwendeten wir einen pharmakologischen Inhibitor namens Bortezomib, der auf Aktivitäten der β5- und β5i/LMP7-Untereinheit im Standard-Proteasom (SP) bzw. Immunproteasom (IP) abzielt. Wir haben zum ersten Mal auf molekularer Ebene gezeigt, dass die Hemmung der Proteasomaktivität durch Bortezomib die Akkumulation von ubiquitylierten Proteinen, proteotoxische Stressreaktionen und die Aktivierung der angeborenen Immunsignalisierung in Abhängigkeit von der induzierten proteotoxischen Stressreaktion, der so genannten unfolded protein response (UPR), in murinen Mikroglia auslöst. Insbesondere die Aktivierung des Inositol-benötigenden Protein-1α-Arms von UPR bei Behandlung mit Bortezomib führt zu systemischer Entzündung, wie durch Typ-I-Interferon (IFN)-Antwort angezeigt wird. IP verbessert die proteolytische Kapazität von UPS durch schnelle Clearance von Proteinen nach Aktivierung der Immunsignalisierung. Mikroglia zeigen wie andere Immunzellen eine konstitutive Expression von IP sowie SP, um ihre zelluläre Proteostase aufrechtzuerhalten. In Manuskript 3 untersuchten wir die besonderen Auswirkungen einer IP-Beeinträchtigung auf die Zellfunktion der Mikroglia. Wir zeigten die Akkumulation von Ubiquitin-modifizierten Proteinen und die Aktivierung proteotoxischer Stressreaktionen in IP-geschädigten Maus- und menschlichen Mikroglia-Modellen. Darüber hinaus identifizierten wir mögliche IP-Substrate in Mikroglia unter Verwendung von β5i/LMP7-Knockout-Mäusen als IP-Mangelmodell und untersuchten, wie IP-Mangel die Mikrogliafunktion beeinflusst. IP-defiziente Mikroglia beeinflussten die Ubiquitylierungsniveaus von Proteinen, die an mehreren Signalwegen wie Immunantworten, Energiestoffwechsel, Organisation des Zytoskeletts, Zellzyklus und Ribosomenfunktion beteiligt sind. Basierend auf der molekularen Analyse bestätigten wir die sterile Aktivierung von Signalmechanismen des angeborenen Immunsystems in IP-geschädigter Mikroglia. Angetrieben wird dies durch die proteotoxische Stresssensor-Proteinkinase R (PKR). Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass eine IP-Beeinträchtigung die Spiegel der Mikroglia-Aktivierungsmarker veränderte, die auch an der Motilität, Adhäsion und Phagozytose von Mikroglia beteiligt sind. In dieser Arbeit heben wir hervor, dass die UPS-Funktion notwendig ist, um die Mikroglia-Proteostase aufrechtzuerhalten, und dass eine Beeinträchtigung der Proteasom-Aktivitäten eine sterile Entzündung in der Mikroglia durch die Aktivierung proteotoxischer Stressreaktionen auslöst. Die beschriebene Aktivierung von Signalmechanismen des angeborenen Immunsystems in Mikroglia bei Beeinträchtigung des Proteasoms kann als neues therapeutisches Ziel für Patienten angesehen werden, die an seltenen Protesomapathien oder anderen Störungen leiden, die mit dysregulierten Immunsignalen verbunden sind.