Open Access

Clarissa Schütz

• An Serin139 phosphoryliertes gamma Histon H2A.X (γH2A.X) hat sich über die Jahrzehnte als sensitiver Surrogat-Endpunkt Strahlen-induzierter DNA-Schäden, insbesondere von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) etabliert. Daher wurde γH2A.X in seiner biomedizinischen Anwendung als geeigneter Marker und genereller Indikator direkter DNA-Schäden anderer Agenzien, beispielsweise niedrig konzentrierter primär exogener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), deren intrazelluläre Effekte weniger direkt auf eine DNA-Oxidation oder das Einfügen von Strangbrüchen abzielen, angesehen. Nicht-thermisches physikalisches Plasma (NTPP), ein teilweise ionisiertes Gas, dessen biochemische Wirkung in vitro hauptsächlich über Freisetzung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) in der flüssigen Phase der Zellumgebung vermittelt wird, setzt lebende Systeme dosisabhängig oxidativem Stress aus und wird therapeutisch in der Wundbehandlung sowie Krebsbehandlung angewendet. Die γH2A.X Quantifizierung wurde häufig zur Beurteilung der Genotoxizität in Plasma-behandelten Zellen verwendet, wobei die NTPP-Exposition in vitro bereits häufig einen γH2A.X Anstieg zeigte, was zu der Hypothese führte, dass ein (oxidativer) DNA-Schaden die direkte Konsequenz Plasma-generierter ROS sei. Darüber hinaus tritt γH2A.X auch während der Apoptose auf, die wiederum selbst mit der NTPP- und ROS-Exposition assoziiert ist. Die vorliegende Arbeit untersuchte die γH2A.X-Induktion in einer Lymphoblasten-Zelllinie bei ROS-Exposition (NTPP, H2O2 oder HOCl) bzw. Behandlung mit UVB-Licht. Durch Verwendung von Antioxidantien wurden sowohl die Zytotoxizität als auch die γH2A.X-Induktion bei allen Arten der ROS-Quellen außer bei UVB-Strahlung aufgehoben. Inhibition der Signalwege für oxidativen Stress (p38-MAPK) und Apoptose (Pan-Caspase) hemmten signifikant die γH2A.X-Induktion bei ROS, jedoch nicht bei UVB-Licht. Letztlich und trotz H2A.X Phosphorylierung führte die UVB-Licht- und eben nicht die NTPP-Exposition zu einer signifikanten Bildung von Mikronuklei (MN), die einen funktionellen Endpunkt genotoxischer DSBs darstellen, sodass trotz der γH2A.X Präsenz kein nachhaltiges mutagenes Potential der medizinischen Plasmabehandlung identifiziert werden konnte. Im Gegensatz zu Strahlen- oder Chemotherapeutika- induziertem und somit DNA-Schaden-assoziiertem γH2A.X zeigen die Daten dieser Arbeit die H2A.X Phosphorylierung weniger als Folge eines ROS-vermittelten primären DNA-Schadens, sondern vielmehr im Licht redox-sensitiver Signalwege der Apoptose, sodass künftige γH2A.X Messungen im medizinischen Bereich, insbesondere in der Plasmamedizin und Redoxbiologie einer sorgfältigen Interpretation bedürfen.
• At serine139 phosphorylated gamma histone H2A.X (γH2A.X) has been established over the decades as sensitive surrogate endpoint of radiation-induced DNA damage, especially DNA double-strand breaks (DSBs) in radiation biology. Therefore, γH2A.X has been considered in its biomedical application a suitable marker and general indicator of direct DNA damage with other therapeutic agents, such as low-dose primarily exogenous reactive oxygen species (ROS), whose intracellular effects are less directly aimed at DNA oxidation or the initiation of strand breaks. Non-thermal physical plasma (NTPP), a partially ionized gas, whose biochemical effect in vitro is mainly mediated via release of reactive oxygen und nitrogen species (RONS) in the liquid phase of the cell environment, exposes living systems to dose-dependent oxidative stress and have been used for therapeutic purposes such as wound healing and cancer therapy. The quantification of phosphorylated H2A.X has often been used to assess genotoxicity in plasma-treated cells, with NTPP exposure in vitro already frequently showing a γH2A.X increase, leading to the hypothesis that (oxidative) DNA damage is a direct consequence of plasma-generated ROS. Moreover, γH2A.X also occurs during apoptosis, which in turn is itself associated with NTPP- and ROS-exposure. The present work investigated the induction of phosphorylated H2A.X in a lymphoblastoid cell line upon ROS exposure (NTPP, H2O2 or HOCl) or treatment with UVB light. Adding antioxidants, both cytotoxicity and γH2A.X induction were abolished for all types of ROS sources except UVB radiation. Inhibition of signaling pathways of oxidative stress (p38-MAPK) and apoptosis (pan-caspase) significantly inhibited induction of γH2A.X upon ROS but not upon UVB light. Ultimately, and despite H2A.X phosphorylation, exposure to UVB light and not to NTPP led to significant formation of micronuclei (MN) representing a functional endpoint of genotoxic DSBs, so that despite the γH2A.X presence, no sustained mutagenic potential of medical plasma treatment could be identified. In contrast to radiation- or chemotherapy-induced and thus DNA-damage-associated γH2A.X, the data of this work present H2A.X phosphorylation to a lesser extent as consequence of ROS-mediated primary DNA damage, but rather in the light of redox-sensitive signaling pathways of apoptosis and oxidative stress, so that future γH2A.X measurements in the medical field, especially in plasma medicine and redox biology, should be carefully interpreted.