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Jan Woyzichovski

• Myxomycetes or Myxogastria (supergroup Amoebozoa) are one of several Protistean groups dispersing via airborne spores. The model organism for the group, so far exclusively studied in a laboratory environment, is Physarum polycephalum. Here, molecular evolution, distribution and the ecology of spores dispersal was investigated for the non-model species Physarum albescens. This nivicolous myxomycete fruits with snow melt in most mountain ranges of the northern hemisphere and disperses via spherical, dark-colored and melanin-rich spores. Fruit body development and subsequent spore dispersal occurs within a short time window of a few days. At this time, the fruiting plasmodium is fully exposed to the harsh environment if the protecting snow melts away. The spores, with a diameter of 10–13 µm of the typical size for myxomycetes, can potentially reach all suitable habitats worldwide, which led to the assumption that not only Ph. albescens but most myxomycete species should be ubiquitously distributed over the world. In the first part of this study (article 1), the question was, if spore dispersal can realize a gene flow sufficient to meet the above-mentioned assumption. A total of 324 accessions of Ph. albescens, collected all over the northern hemisphere, was sequenced for 1-3 genetic markers (SSU, EF1A, COI), and 98 specimens were further analyzed using the genotyping by sequencing technique. As a result, at least 18 reproductively isolated units, which can be seen as cryptic biological species, emerged as phylogroups in a three-gene phylogeny, but as well in a SNP-based phylogeny and were confirmed by a recombination analysis between the three markers. However, this evolutive radiation is not simply caused by geographic fragmentation due to low dispersal capability: within a certain region, multiple phylogroups coexisted next to each other, although some appeared to be regional endemics. Most likely, mutations in mating-type genes, as shown to exist for the cultivable Ph. polycephalum, are the main drivers of speciation. This challenges the hypothesis of ubiquitous distribution of Ph. albescens and corroborates the results of the few available studies for other myxomycete species. In addition, groups of clonal specimens, mostly but not always restricted to a certain slope or valley indicated that sexual and asexual reproduction coexists in the natural populations of Ph. albescens. In the second part (articles 2), the fundamental niche for Ph. albescens was described using all available records for the species. The resulting set of 537 unique occurrence points was subjected to a correlative spatial approach using the software MaxEnt. In dependence on the predictor variables three species distribution models emerged which differed only in details. The first consisted of only 19 bioclimatic variables and an elevation map from the WorldClim dataset. The second was corrected for pseudo-absences resulting from missing survey activities, and the third was expanded with an additional categorical environment variable on snow cover. High mean AUC (area under the curve) values above 0.97 could be reached with all three models. Variables for snow cover, precipitation of the coldest quarter (of the year), and elevation correlated highly to predict the distribution of Ph. albescens. Only in mid-northern latitudes, elevation alone was a good predictor, but it would cause false-positive predictions in arid mountain ranges and failed to explain occurrence in lowland sites at higher latitudes. Mountains in humid climates showed the highest incidences, confirming recent studies that long-lasting snow covers combined with mild summers are crucial for the ecological guild of nivicolous myxomycetes, with Ph. albescens as a typical species. Spore size is crucial for dispersal ability and should thus be a character under strong selection. In addition, spores carrying two nuclei with opposite mating types should have a colonization advantage. This was the hypothesis for the last part of this study (articles 3 and 4), which investigated this trait in a quantitative manner. This required a method to analyze thousands of spores automatically (article 3) and with high precision for size and the number of nuclei enclosed. Human errors should be excluded, to reveal even subtle differences in the resulting spore size distributions. Two challenges had to be met for this approach. First, a preparation technique was developed to reduce false segmentations due to overlaying spores by aligning spores on one common plane with a high-frequency vibration device. Second, the segmentation process was automated to allow separating spores that are densely packed in the respective images. A machine learning algorithm was set up and trained to reliable identify and measure dark-colored spores. The technique produced consistent results with high accuracy, and the large number of spores allowed to compile spore size distributions, to check for the constancy of this character, which is impossible with manual measurements limited to low numbers. The resulting spore size distributions, obtained from over 80 specimens (article 4), were mostly narrow, which is in accordance with our hypothesis. Spore size was as well fairly constant within fructifications from one colony. However, mean spore size within different accessions of Ph. albescens showed large variation (ca. 10%, a range often indicated to key out different morphospecies of myxomycetes), and this was explained only by a minor part with differences between biospecies. Not much smaller (8%) was the variation within a group of clonal specimens collected within 25 m distance. This points to a strong influence of environmental factors even at a micro spatial scale, perhaps caused by microclimatic differences and high phenotypic plasticity for spore size. The influence of large-scale covariates like altitude or latitude was negligible. However, spore size correlated with the variance in this trait, indicating that oversized spores may be caused by detrimental environmental conditions. Two aberrations in spore development were found: First, a few specimens showed a multimodal distribution for spore size with two or even three discernible spore populations. The estimated volumes of those populations correspond to a multiple of the first and most abundant conspicuous spore size population. Second, not all spores were uninucleate as to be expected for meiotic products. This was revealed by fluorescence signals from staining the same spores with DAPI, with a second machine learning algorithm trained to identify the nuclei in a spore. A few specimens showed a significant proportion of binucleated spores in the size range of normal-sized ones, and these specimens were not the ones with multimodal spore size distributions. This indicates that the negative impacts (inbreeding) of multinucleate spores should outweigh a possible colonization advantage and is in accordance with the high genetic diversity found in the worldwide population of Ph. albescens, indicating predominantly sexual reproduction in wild populations of myxomycetes.
• Myxomyceten oder Myxogastria (Supergruppe Amoebozoa) sind eine von mehreren Gruppen innerhalb der Protisten, die sich hauptsächlich über windverbreitende Sporen ausbreiten. Der bisher ausschließlich im Labor untersuchte Modellorganismus dieser Gruppe ist Physarum polycephalum. Hier wurde die molekulare Evolution, Verteilung und die Ökologie der Sporenausbreitung für den Nicht-Modellorganismus Physarum albescens untersucht. Diese nivicole Myxomyceten bildet Fruchtkörper mit dem Einsetzen der Schneeschmelze in den meisten Gebirgszügen der nördlichen Hemisphäre und verbreitet sich über kugelförmige, dunkel gefärbte und melaninreiche Sporen. Die Fruchtkörperentwicklung und anschließende Sporenausbreitung erfolgt innerhalb eines kurzen Zeitfensters von nur wenigen Tagen. Zu diesem Zeitpunkt ist das Plasmodium vollständig den rauen Umweltbedingungen ausgesetzt, sobald die schützende Schneeschnicht nicht mehr besteht. Die Sporen mit einem Durchmesser von 10–13 μm, der für Myxomyceten typischen Größe, können potenziell alle geeigneten Lebensräume weltweit erreichen. Dies führte zur Annahme, dass nicht nur Ph. albescens, sondern die meisten Myxomycetenarten ubiquitär über die Welt vorkommen sollten. Der erste Teil in dieser Arbeit (Artikel 1) war es daher zu klären, ob die Sporenausbreitung einen Genfluss realisieren kann, der ausreicht, um die eben genannte Annahme zu bestätigen. Insgesamt 324 Proben von Ph. albescens, die auf der gesamten nördlichen Hemisphäre gesammelt wurden, wurden für 1-3 genetische Marker (SSU, EF1A, COI) sequenziert und 98 Proben wurden mit der Genotypisierung durch Sequenzierungstechnik weiter analysiert. Infolgedessen konnten mindestens 18 reproduktiv isolierte Einheiten entdeckt werden, die als kryptische biologische Spezies angesehen werden können. Diese Phylogruppen waren das Ergebnis einer Drei-Gen-Phylogenie, aber auch einer SNP-basierten Phylogenie und wurden durch eine Rekombinationsanalyse zwischen diesen drei Markern weiter bestätigt. Diese evolutive Auffächerung wird jedoch nicht einfach durch geografische Fragmentierung aufgrund der geringen Ausbreitungsfähigkeit verursacht: Innerhalb einer bestimmten Region koexistierten mehrere Phylogruppen nebeneinander, obwohl einige regionale endemisch zu sein schienen. Höchstwahrscheinlich sind Mutationen in den “mating type” Genen, wie sie für den kultivierbaren Ph. polycephalum vorgewiesen wurden, die Haupttreiber der Artbildung. Dies stellt die Hypothese der ubiquitären Verteilung von Ph. albescens in Frage und bestätigt die Ergebnisse der wenigen verfügbaren Studien über andere Myxomycetenarten. Darüber hinaus deuteten Gruppen klonaler Exemplare, die meist, aber nicht immer auf einen bestimmten Hang oder ein bestimmtes Tal beschränkt sind, darauf hin, dass sexuelle und asexuelle Fortpflanzung in den natürlichen Populationen von Ph. albescens koexistieren. Im zweiten Teil (Artikel 2) wurde die fundamentalen Nische für Ph. albescens unter Verwendung aller verfügbaren Aufzeichnungen für die Art beschrieben. Der resultierende Datensatz von 537 eindeutigen Vorkommnissen wurde mit der Maximum-Entropie-Methode der Software MaxEnt genutzt, um eine Habitatmodellierung zu erstellen. In Abhängigkeit von den Einflussvariablen entstanden drei Verteilungsmodelle, die sich nur im Detail unterschieden. Das erste Modell bestand aus nur 19 bioklimatischen Variablen und einer Höhenkarte aus dem WorldClim-Datensatz. Das zweite wurde von Pseudo-Abwesenheiten korrigiert und die dritte wurde um eine zusätzliche kategoriale Einflussvariable, basierend auf Schneebedeckung, erweitert. Mit allen drei Modellen konnten hohe durschnittliche AUC-Werte (Fläche unter der Kurve) über 0,97 erreicht werden. Die Variablen für Schneebedeckung, Niederschlag des kältesten Quartals (des Jahres) und Höhe korrelierten am stärksten, um die Verteilung von Ph. albescens vorherzusagen. Nur in mittleren nördlichen Breitengraden war die Variable “Höhe” allein ein guter Prädiktor, aber in den trockenen Gebirgszügen führte es zu falsch-positive Vorhersagen und konnte zudem auch nicht das Vorkommen in Tieflandstandorten in höheren Breiten erklären. Berge in feuchten Klimazonen zeigten die höchsten Inzidenzen, was neuere Studien bestätigt, dass lang anhaltende Schneedecken in Kombination mit milden Sommern für die ökologische Gruppe der nivicolen Myxomyceten, mit Ph. albescens als typischer Art, von entscheidender Bedeutung sind. Die Sporengröße ist ein entscheidender Faktor für die Ausbreitungsfähigkeit und sollte daher ein Charakter unter starker Selektion sein. Darüber hinaus sollten Sporen, die zwei Kerne mit komplementären Paarungstypen tragen (“mating type” System), einen Kolonisationsvorteil haben. Dies war die Hypothese für den letzten Teil dieser Studie (Artikel 3 und 4), der dieses Merkmal quantitativ untersuchte. Dies erforderte eine Methode, um Tausende von Sporen automatisch (Artikel 3) und mit hoher Präzision, bezüglich Größe und Anzahl, zu analysieren. Der menschliche Fehler sollten so gut wie möglich ausgeschlossen werden, um auch subtile Unterschiede in den resultierenden Sporengrößenverteilungen aufzudecken. Für diesen Ansatz mussten zwei Herausforderungen bewältigt werden. Zuerst wurde eine Präparierungstechnik entwickelt, um falsche Segmentierungen aufgrund von Überlagerungen zu reduzieren. Dazu wurden Sporen auf einer gemeinsamen Raumebene mit einer hochfrequenten Vibrationsvorrichtung ausgerichtet. Zweitens wurde der Segmentierungsprozess automatisiert und optimiert, um Sporen zu trennen, die in den jeweiligen Bildern zu dicht gepackt sind. Ein maschineller Lernalgorithmus wurde eingerichtet und trainiert, um dunkel gefärbte Sporen zuverlässig zu identifizieren und zu messen. Die Technik lieferte stabile Ergebnisse mit hoher Genauigkeit. Die große Anzahl von untersuchten Sporen erlaubte es, Sporengrößenverteilungen zu erstellen, um die Konstanz dieses Charakters zu überprüfen, was mit manuellen Messungen, die auf niedrige Zahlen beschränkt sind, unmöglich ist. Die resultierenden Sporengrößenverteilungen, die für über 80 Exemplare (Artikel 4) erhalten wurden, waren meist schmal verteilt, was unserer Hypothese entsprach. Die Sporengröße war innerhalb von Fruktifikationen aus einer Kolonie konstant. Die durchschnittliche Sporengröße innerhalb verschiedener Sammlungen von Ph. albescens zeigte jedoch große Unterschiede (ca. 10%, ein Bereich, der oft angegeben wird, um verschiedene Morphospezies von Myxomyceten herauszufiltern), und dies wurde nur durch einen kleinen Teil mit Unterschieden zwischen Biospezies erklärt. Nicht viel kleiner (8%) war die Variation innerhalb einer Gruppe klonaler Exemplare, die innerhalb von 25 m Entfernung gesammelt wurden. Dies deutet auf einen starken Einfluss von Umweltfaktoren auch auf mikroräumlicher Skala hin, der möglicherweise durch mikroklimatische Unterschiede und einer hohen phänotypischen Plastizität für die Sporengröße verursacht wird. Der Einfluss großräumiger Kovariate wie Höhe oder Breitengrad war vernachlässigbar. Die Sporengröße korrelierte jedoch mit der Varianz dieses Merkmals, was darauf hindeutet, dass übergroße Sporen durch schädliche Umweltbedingungen verursacht werden können. Zwei Abweichung in der Sporenentwicklung wurden gefunden: Erstens zeigten einige Exemplare eine multimodale Verteilung für die Sporengröße mit zwei oder sogar drei erkennbaren Sporenpopulationen. Die geschätzten Volumina dieser Populationen entsprechen einem Vielfachen der ersten und am häufigsten vorkommenden Population in Sporengröße. Zweitens waren nicht alle Sporen einkernig, wie es bei meiotischen Produkten zu erwarten ist. Dies wurde durch Fluoreszenzsignale aus der Färbung der gleichen Sporen mit DAPI aufgedeckt, wobei ein zweiter maschineller Lernalgorithmus trainiert wurde, um die Kerne in einer Spore zu identifizieren. Einige Exemplare zeigten einen signifikanten Anteil an zweikernigen Sporen im Größenbereich normaler Sporengröße, und diese Exemplare waren nicht diejenigen mit multimodalen Sporengrößenverteilungen. Dies deutet darauf hin, dass die negativen Auswirkungen (Inzucht) von mehrkernigen Sporen einen möglichen Kolonisationsvorteil überwiegen sollten, und steht damit im Einklang mit der hohen genetischen Vielfalt, die in der weltweiten Population von Ph. albescens gefunden wurde. Das wiederum weist auf eine überwiegend sexuelle Fortpflanzung in wilden Populationen von Myxomyceten hin.