Open Access

Julia Lettow

• Zur Untersuchung molekularer Prozesse sind die Wechselwirkungen der beteiligten Faktoren von zentraler Bedeutung, was besonders für die präzise Steuerung der eukaryotischen Genregulation zutrifft, die im Mittelpunkt dieser Arbeit steht. Die Transkription wird durch den Zusammenbau des Präinitiationskomplexes (PIC) am Promotor der Zielgene initiiert. Neben der RNA-Polymerase II, dem Mediatorkomplex und mehreren generellen Transkriptionsfaktoren sind daran Aktivatorproteine beteiligt, welche an UAS-Elemente (upstream activation site) im Promotor binden. Daneben können aber auch Repressoren an URS-Elemente (upstream repression site) binden oder mit Promotor- gebundenen Aktivatoren interagieren und durch Rekrutierung sog. Corepressoren (z. B. Sin3, Cyc8 und Tup1) die Transkription hemmen. Diese Corepressoren können dann über assoziierte Histon- deacetylasen (z. B. Rpd3) die Chromatinstruktur im Promotorbereich spezifischer Gene verdichten und damit eine Bindung der Transkriptionsmaschinerie verhindern. In der Regel führt dies zu einer reduzierten Expression des jeweiligen Gens. Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen genspezifischen Repressoren und pleiotropen Corepressoren haben in der Vergangenheit bereits zur Identifizierung einzelner Sequenzmotive und individueller Strukturen geführt. Um dieses Netzwerk zu ergänzen, wurden in dieser Arbeit zahlreiche Repressor-Corepressor-Interaktionen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae in vitro und in vivo charakterisiert und durch Verkürzung der interagierenden Proteine (Dal80, Mot3, Sko1, Ure2, Xbp1 und Yox1) hierfür relevante Aminosäuresequenzen ermittelt. Durch systematische Vergleiche solcher Repressorsequenzen konnten Varianten eines hydrophob-amphipathischen Konsensusmotivs identifiziert und z. T. durch gerichtete Mutagenese als funktionell wichtig nachgewiesen werden. Sekundärstrukturvorhersagen zeigten oft die Beteiligung α-helikaler, aber auch β-Faltblatt- oder ungeordneter Strukturen. Diese strukturelle Varianz lässt die Vermutung zu, dass es sich bei solchen Corepressor-Interaktionsdomänen (CID) um IDRs (intrinsically disorderd regions) handeln könnte, die erst durch Kontaktherstellung zum Corepressor eine definierte Konformation annehmen. Ein in dieser Arbeit intensiv untersuchter Repressor war Gal80, der bekanntermaßen das GAL-System der Hefe solange abschaltet, bis Galactose als induzierender Zucker verfügbar ist. Man unterscheidet hierbei drei Zustände: Die Glucoserepression beschreibt das Abschalten der GAL-Gene durch den Repressor Mig1 bei Glucoseverfügbarkeit. Bei Glucosemangel und Verfügbarkeit einer alternativen Kohlenstoffquelle (z. B. Lactat oder Ethanol) wird der Aktivator Gal4 synthetisiert und bindet an UASGAL- Motive in Promotoren der GAL-Gene. Unter diesen Derepressionsbedingungen wird die Transkriptionsaktivierungsdomäne von Gal4 noch durch den Gal80-Repressor maskiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Gal80 zusätzlich in der Lage ist, den Corepressorkomplex Cyc8/Tup1 zu rekrutieren und die Transkription der Strukturgene dadurch zu reprimieren. Chromatinimmunopräzi- pitationsstudien belegten die Gal80-abhängige Präsenz der Corepressoren Cyc8 und Tup1 am GAL1 Promotor. Außerdem stellte sich bei der Charakterisierung von cyc8 und tup1 Mutantenstämmen heraus, dass Corepressoren durchaus auch aktivierende Wirkungen entfalten können. So fiel die Expression eines GAL1-lacZ Reportergens in einer cyc8 Nullmutante unter allen getesteten Bedin- gungen geringer aus als im Wildtyp. Die duale Wirkung solcher Transkriptionsfaktoren wurde in der Vergangenheit immer wieder beobachtet und steht auch im Einklang mit den Befunden dieser Arbeit.
• The focus of this work was to study the interactions of different factors which are important for molecular processes in eukaryotic gene regulation. Transcription mediated by the promoter of target genes is initiated by the assembly of the preinitiation complex (PIC), comprising RNA-Polymerase II, the mediator complex and several general transcription factors. Transcription is stimulated by activator proteins which bind to upstream activation sites (UAS) within the promoter. In contrast, repressors bind to upstream repression sites (URS) or deactivate promoter-bound activators by recruiting corepressors (e.g. Sin3, Cyc8 and Tup1) which condense the chromatin structure of specific target genes using associated histone deacetylases (e.g. Rpd3). This prevents binding of the transcription machinery and reduces gene expression. Studies of interactions between gene-specific repressors and pleiotropic corepressors previously led to the identification of individual sequence and structural motifs. To continue such investigations and to complement the regulatory network, this work characterized several repressor-corepressor interactions in the yeast Saccharomyces cerevisiae in vitro and in vivo by studying length variants of repressor proteins (Dal80, Mot3, Sko1, Ure2, Xbp1, Yox1) and identifying relevant amino acid sequences which are required for interaction. Systematic comparisons of such repressor sequences allowed identification of variants of a hydrophobic-amphipathic pattern some of which could be confirmed as functional important by site-directed mutagenesis. Predictions of secondary structures often revealed the involvement of α-helical, but also β-sheet or disordered structures. These structural variations suggest that corepressor interaction domains (CIDs) may be intrinsically disordered regions (IDRs) which adopt a defined conformation only by contacting the specific corepressor. One repressor intensively studied in this work was Gal80 which is known to shut down the yeast GAL system until galactose is available as an inducing substrate. Three regulatory states can be distinguished: Glucose repression describes the switch-off of GAL gene expression by the repressor Mig1 upon glucose availability. In the absence of glucose and availability of an alternative carbon source (e.g. lactate or ethanol), the activator Gal4 is synthesized and binds to UASGAL motifs in the GAL promoters. Under these derepression conditions, the transcriptional activation domain of Gal4 is still masked by the Gal80 repressor. In this work, Gal80 was shown to be additionally capable of recruiting the Cyc8/Tup1 corepressor complex and thereby repressing transcription of structural genes. Chromatin immunoprecipitation studies demonstrated the Gal80-dependent presence of corepressors Cyc8 and Tup1 at the GAL1 promoter. In addition, characterization of cyc8 and tup1 mutant strains revealed that corepressors can also mediate activating effects. This is evident from the finding that expression of a GAL1-lacZ reporter gene in a cyc8 null mutant was lower than in the wild type under all tested conditions. The dual effect of these pleiotropic transcription factors has been observed repeatedly in the past and is also consistent with the findings of this work.