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Sven Ostermann

• Gram-negative bacteria are known to naturally produce outer membrane vesicles (OMVs), which are closed nanoparticles (10 to 450 nm) containing virulence factors and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). For over 20 years, OMVs of Neisseria meningitidis (N. meningitidis), in combination with three purified outer membrane proteins, have been successfully used as parts of human vaccines which illustrates the safety and potential of OMV based vaccines. So far only little is known about the OMVs of fish pathogenic bacteria. The production of OMVs has been described for the fish pathogenic gram-negative bacterium Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) which is the causative agent of furunculosis resulting in high morbidity and mortality of salmonid fish. The immunostimulatory potential of OMVs derived from A. salmonicida as well as the possibility of establishing an oral vaccine model in Oncorhynchus mykiss (O.mykiss) (Rainbow trout) has been investigated in this study by conducting in vitro and in vivo experiments. Innate immune cells such as macrophages are one of the first cells to respond to pathogens once they breach the skin barrier, therefore the monocyte/macrophage cell line RTS-11 as well as leukocytes from the head kidney, consisting of a high percentage of phagocytic cells have been investigated. Additionally, leukocytes isolated from the peritoneal cavity as the main target for injectable vaccines have been studied in the in vitro experiments. These experiments indicate that OMVs derived from A. salmonicida are recognized by the monocyte/macrophage cell line RTS-11 as well as by leukocytes from the head kidney resulting in significant changes of the mRNA expression pattern of early inflammatory markers (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TGFβ). Having used the established peritoneal inflammation model of rainbow trout it could be shown that intraperitoneal (i.p.) vaccination of rainbow trout with OMVs results in a similar local immune response, especially in the recruitment of myeloid cells, compared to the injection of inactivated bacteria. The systemic cellular immune response differed between the two vaccine groups, even though a similar humoral immune response could be observed. Interestingly, i.p.vaccination with 10 µg of OMVs resulted in similar antibody titers as observed for fish, that were i.p. vaccinated with 108 CFU of inactivated A. salmonicida. The similar antibody titers after vaccination with OMVs might be explained by a stronger activation of CD8- T cells (likely CD4+ T cells) in the head kidney as well as in the blood in the OMV vaccinated group alone, which might result in an increased stimulation of B cells to produce antibodies. Oral vaccination has been described as the ideal vaccination method for fish, but only few vaccines for oral application are licensed. Therefore, the established oral model for vaccination of rainbow trout with attenuated viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) was adapted to be used for inactivated A. salmonicida, even though initial trials indicated great similarities in the cellular response after i.p. and oral vaccination with inactivated strains of A. salmonicida, particularly in the response of the myeloid cells and lymphocytes in the target organs as well as the thrombocytes in the spleen. This could not be confirmed in a second oral vaccination trial. These results show how challenging the development of oral vaccines for fish is. The main challenge is the reproducibility of reliable results, since this is influenced by the difference in uptake of vaccine pellets or antigen degradation in the gut. Future oral vaccine trials should investigate different vaccination regimes, e.g., consecutive feeding, or a different composition of vaccine pellets, in order to further investigate the possibility of establishing an oral vaccine model for trout and so that future vaccine candidates, like OMVs, can be reliably tested in fish.
• Es ist bekannt, dass Gram-negative Bakterien äußere Membran Vesikel (OMVs) produzieren, welches geschlossene Nanopartikel sind (10 bis 450 nm) die Virulenzfaktoren sowie pathogen-assoziierter molekulare Strukturen beinhalten (PAMPs) (1, 2). Seit über 20 Jahren werden die OMVs von Neisseria meningitidis in Verbindung mit drei aufgereinigten Proteinen der äußeren Membran erfolgreich als Impfstoff eingesetzt, dies zeigt die Sicherheit und das Potenzial von Impfstoffen auf Basis von OMVs (1, 3-5). Bisher ist nur wenig über die OMVs von pathogenen Fischbakterien bekannt (6-9). Die Produktion von OMVs wurde für das Gram-negative Fisch-bakterium Aeromonas salmonicida beschrieben (10), welches für die Erkrankung Furunkulose verantwortlich ist, wodurch eine hohe Krankheits- und Sterblichkeitsrate in Salmoniden her-vorgerufen wird (11). Die Analyse des immunstimulatorischen Potenzials von OMVs, isoliert von A. salmonicida, so-wie die Möglichkeit, ein Model für die Testung von oralen Impfstoffen in Oncorhynchus mykiss (Regenbogenforelle) zu etablieren, waren die Hauptthemen dieser Arbeit. Zellen des angebo-renen Immunsystems, wie z.B. Makrophagen, gehören zu den ersten Zellen, die auf Pathogene reagieren, welche den natürlichen Schutz z.B. der Haut durchbrochen haben (12). Um die Re-aktion der Zellen des angeborenen Immunsystems auf OMVs isoliert von A. salmonicida zu untersuchen, wurde die Monozyten/Makrophagen-Zelllinie RTS-11 sowie Leukozyten der Kopfniere, welche zu großen Teilen aus phagozytierenden Zellen bestehen (13), und Leukozy-ten aus der Bauchhöhle, welche das Hauptziel für injizierbare Impfstoffe ist (14), in in vitro-Experimenten untersucht. Diese Experimente haben gezeigt, dass OMVs, isoliert von A. sal-monicida, von der Monozyten/Makrophagen Zelllinie-RTS-11 sowie von Leukozyten der Kopf-niere erkannt werden und zu signifikanten Unterschieden in der mRNA-Expression von frühen Entzündungsmarkern führen (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TGFβ). Durch die Nutzung des etablierten Entzündungsmodells der Peritonealhöhle in Oncorhynchus mykiss (Regenbogenforellen) (15) konnte gezeigt werden, dass die intra-peritoneale (i.p.) Impfung von Regenbogenforellen mit OMVs zu einer ähnlichen zellulären Immunantwort führt, insbesondere dem Einstrom von myeloiden Zellen, wie nach einer i.p. Impfung mit inaktivierten Bakterien beobachtet wurde. Die systemische zelluläre Immunantwort zeigte hingegen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, obwohl ein ähnlicher Verlauf der humoralen Immunantwort beobachtet werden konnte. Interessanterweise hat die i.p. Impfung mit 10 μg OMVs zu einem vergleichbar hohen Antikörpertiter geführt wie bei Fischen, die mit 108 Koloniebildende Einheiten (KBE) inaktivier-ter A. salmonicida geimpft wurden. Dies könnte vielleicht durch eine frühzeitige und stärkere Aktivierung von CD8- T-Zellen (wahrschein CD4+ T-Zellen (16)) in der Kopfniere sowie im Blut durch die Impfung mit OMVs erklärt werden, was zum Beispiel in dieser Gruppe allein zu einer erhöhten Stimulation von B-Zellen zur Antikörperproduktion führen könnte. Die orale Impfung wurde als die ideale Strategie zur Impfung von Fischen beschrieben, aber nur wenige oral applizierbare Impfstoffe sind kommerziell erhältlich (17, 18). Um ein Modell für die Analyse oraler Impfstoff zu entwickeln wurde das bereits etablierte Modell zur oralen Impfung von Regenbogenforellen mit attenuiertem VHSV (19) für die Nutzung mit inaktivier-ten A. salmonicida abgeändert. Die ersten Tierversuche zeigten eine große Ähnlichkeit in der zellulären Immunantwort zwischen i.p. und oraler Immunisierung, insbesondere bei der Zell-migration der myeloiden Zellen und der Lymphozyten im Zielorgan, sowie den Thrombozyten in der Milz. Weitere Tierversuche konnten dies nicht bestätigen, wodurch wieder einmal die Schwierigkeiten in der Entwicklung eines oralen Impfstoffes verdeutlicht werden. Das größte Problem in der Entwicklung oraler Impfstoffe liegt in der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse (20), bedingt durch zum einen die unterschiedliche Anzahl an aufgenommenen Impfpellets und zum anderen durch die Zersetzung von Antigen im Magen der Fische (21). Zukünftige orale Impfversuche sollten auch die Möglichkeit von unterschiedlichen Fütterungs-regimen, wie zum Beispiel aufeinanderfolgenden Fütterungen, oder die Zusammensetzung der Impfpellets betrachten, um die Etablierung eines oralen Impfstoffmodells für die Analyse von möglichen Impfstoffkandidaten, wie zum Beispiel OMVs, in Regenbogenforellen zu etablieren.