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Stefanie Herde

• Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste Herzrhythmusstörung im Erwachsenenalter. In den kommenden Jahren und Jahrzehnten werden die Prävalenz und Inzidenz von Vorhofflimmern weiter zunehmen. Die VHF-assoziierten Pathomechanismen sind nicht vollständig geklärt. Derzeitige Therapieansätze sind oft nur zeitlich begrenzt wirksam, mit starken Nebenwirkungen behaftet und können aktuelle Beschwerden der Patienten zwar eindämmen, ein Fortschreiten der Krankheit aber nicht aufhalten. Daher ist es notwendig, weitere Untersuchungen auf Ebene der Zellregulation und Zellkommunikation zu fördern, um das Wissen über Entwicklung, Progression und Reversibilität von VHF-assoziierten Remodeling-Prozessen zu erweitern und neue therapeutische Interventionspunkte zu identifizieren. VHF-induzierte atriale Remodeling-Prozesse werden maßgeblich und zum Teil ursächlich durch reversible Veränderungen der Protein-Phosphorylierung verursacht. In vorherigen Arbeiten des Labors konnten bereits im Rahmen von Phosphoproteom-Analysen Proteine in HL-1 Zellen detektiert werden, die nach Rapid Pacing (RP) auffällig differentiell reguliert waren. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Analyse und Verifizierung dieser Proteine nach kontinuierlichem und Intervall-RP von HL-1 Zellen auf mRNA- und Proteinebene. Der Vergleich der im HL-1-Modell erhaltenen Daten mit denen, die aus atrialem Gewebe von Patienten in SR und VHF gewonnen wurden, soll Rückschlüsse auf klinisch und therapeutisch potenziell relevante Signalwege und Pathomechanismen bei VHF geben. Es stellte sich heraus, dass RP keinen Einfluss auf die mRNA-Expression von DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2 und eingeschränkt auf JPH2 und GPX1 in HL-1 Zellen hatte. Lediglich nach Intervall-RP war die mRNA-Menge von JPH2 erhöht und von GPX1 reduziert. Sowohl nach kontinuierlichem als auch nach Intervall-RP war die Genexpression der Proteine SNIP1 und SBK2 stark reduziert. Gleichzeitig stellte sich eine ebenso stark reduzierte SBK2 Proteinexpression sowohl in den HL-1 Zellen als auch im humanen Vorhofgewebe bei VHF dar. In der immunhistochemischen Untersuchung atrialer Gewebeschnitte präsentierte sich SBK2 im Zytoplasma, entlang der Zellmembran und vesikelartig im perinukleären Raum der humanen Kardiomyozyten. RP und VHF hatten keinen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression von MARK2 in den HL-1 Zellen und im humanen Vorhofgewebe. In der Untersuchung der Protein-Phosphorylierung von MARK2 an Thr208 ergaben sich allerdings Diskrepanzen zwischen den murinen und humanen Zellen. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde in den humanen Kardiomyozyten für MARK2 eine regelmäßige Anordnung in longitudinaler Ausrichtung und zwischen den Z-Linien nachgewiesen. Eine VHF-abhängige durch Phosphorylierung vermittelte subzelluläre Translokation von MARK2 konnte ausgeschlossen werden. Diese RP-assoziierten Veränderungen im Phosphoproteom sind am atrialen Remodeling, bei der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Aktivierung des TGF-β- und NF-κB-Signalwegs involviert. Des Weiteren wird ein Zusammenhang zwischen MARK2 und dem Wnt-Signalweg vermutet. In weiterführenden Arbeiten sollten Untersuchungen der spezifischen Effekte von Protein-Phosphorylierungen und der Protein-Protein-Interaktionen erfolgen. Da zu den kardialen Funktionen von SBK2 keine Daten vorliegen, könnten mithilfe des Knock-outs von SBK2 (Knock-out Maus oder CRISPR-Cas9 Knock-out in HL-1 Zellen) grundlegende Aussagen zu dessen Rolle im gesunden Herzen oder bei VHF erhalten werden.
• Atrial fibrillation (AF) is the most common cardiac arrhythmia in adults. In the coming years and decades, the prevalence and incidence of AF will further increase. The AF-associated pathomechanisms are not yet completely researched. Current therapeutic approaches are effective just for a limited time, associated with severe side effects and may alleviate symptoms, but cannot stop the progression of the disease. Therefore, it is necessary to promote further investigations in cell regulation and cell communication to increase the knowledge of development, progression, and reversibility of AF-associated remodeling processes and to identify new points of therapeutic intervention. AF-induced atrial remodeling processes are mainly caused by reversible changes in protein phosphorylation. In previous work of the laboratory, phosphoproteomic analyses revealed proteins in HL-1 cells that were noticeably differentially regulated after rapid pacing (RP). In this work, these proteins were analyzed and verified in mRNA and protein levels after continuous and interval RP of HL-1 cells. Comparison of the results of the HL-1 model and the atrial tissue of patients in SR and AF should allow for conclusions to clinically and therapeutically relevant signaling pathways and pathomechanisms in AF. The results proved that RP had no effect on the mRNA expression of DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2, and limited effect on JPH2 and GPX1 in HL-1 cells. Only after interval RP, the mRNA level of JPH2 was increased while GPX1 was decreased. After both continuous and interval RP, gene expression of SNIP1 and SBK2 was significantly reduced. At the same time, SBK2 protein expression was also significantly reduced in both HL-1 cells and atrial tissue in patients with AF. In immunohistochemical examination of human atrial tissue sections SBK2 presented in the cytoplasm, along the cell membrane, and vesicle-like in the perinuclear space of human cardiomyocytes. RP and AF had no effect on gene and protein expression of MARK2 in HL-1 cells and human atrial tissue. However, the protein phosphorylation of MARK2 on Thr208 revealed differences between murine and human cells. Using immunofluorescence, MARK2 was detected in a regular arrangement in longitudinal alignment and between Z-lines in the human cardiomyocytes. AF-dependent phosphorylation-mediated subcellular translocation of MARK2 could be excluded. These RP-associated changes in the phosphoproteome are involved in atrial remodeling, increasing oxidative stress and activating the TGF-β and NF-κB pathways. Furthermore, a link between MARK2 and the Wnt signaling pathway is suspected. Further, it is necessary to investigate the specific effects of protein phosphorylation and protein-protein interactions. Since there is no data available on the cardiac functions of SBK2, knock-out of SBK2 (knock-out mouse or CRISPR-Cas9 knock-out in HL-1 cells) could provide basic information on its role in the healthy heart or in AF.