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Christina Krüger

• The development of the two main types of diabetes mellitus, type 1 and type 2 (T1D, T2D), is closely associated with the formation of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in insulin-secreting pancreatic β-cells. In T1D, β-cell death is triggered by proinflammatory cytokines, which mainly lead to the formation of ROS in mitochondria and RNS in the cytosol. Pancreatic β-cells are extraordinarily sensitive to oxidative stress due to their low glutathione peroxidase and catalase expression. Thus, hydrogen peroxide (H2O2) cannot be detoxified, neither sufficiently, nor rapidly. H2O2 itself is a rather weakly reactive ROS but can react in the Fenton reaction to form highly reactive hydroxyl radicals (●OH), that can damage cells in a variety of ways and induce cell death. The cell and its organelles are bounded by biological membranes that differ in their permeability to H2O2. Aquaporins (AQPs) are water-transporting transmembrane proteins, and some isoforms have been shown to facilitate a bidirectional transport of H2O2 across cellular membranes in addition to water. The role of AQP8 was investigated in an insulin-producing cell model by stably overexpressing AQP8 (AQP8↑) and by a CRISPR/Cas9-mediated AQP8 knockout. However, AQP8 proved to be an essential protein for the viability of the insulin-producing RINm5F cells, and so we established a tet-on-regulated AQP8 knockdown (AQP8 KD). Our results highlight that AQP8 is involved in H2O2 transport across the plasma and mitochondrial membranes, and that AQP8 expression gets upregulated by proinflammatory cytokines (in vitro) and in an acutely diabetic rat model (in vivo). Furthermore, it was shown that the increased proinflammatory cytokine toxicity is due to enhanced mitochondrial oxidative stress, because H2O2 cannot be efficiently transported in AQP8 KD cells and ●OH are increasingly generated. Caspase activity then raises, and apoptosis is increasingly induced coupled with a proportion of ferroptosis-mediated cell death because of a concomitant decrease in nitric oxide (NO●) concentration. In conclusion, AQP8 is localized in the plasma and mitochondrial membrane of insulin-producing RINm5F cells, where it is involved in H2O2 transport. In T1D, AQP8 plays an important role in the transport of H2O2 from the mitochondrial matrix to the cytosol so that the concentration is lowered in the mitochondria. This wider distribution of H2O2 may ease the inactivation of H2O2.
• Die Entstehung der beiden Haupttypen des Diabetes mellitus, Typ 1 und Typ 2 (T1DM, T2DM), ist eng mit der Bildung reaktiver sauerstoffspezies (ROS), sowie reaktiver Stick- stoffspezies (RNS) in Insulin-sezernierenden β-Zellen des Pankreas verbunden. Beim T1DM wird der β-Zelltod durch proinflammatorische Zytokine ausgelöst, die hauptsächlich in den Mitochondrien zur Bildung von ROS und im Zytosol von RNS führen. Pankreatische β-Zellen sind aufgrund ihrer geringen Glutathionperoxidase- und Katalase-Expression außerordentlich empfindlich gegenüber oxidativem Stress. Das gebildete Wasserstoffperoxid (H2O2) kann somit nicht ausreichend schnell abgebaut werden. H2O2 selbst ist eine eher wenig reaktive ROS, kann jedoch in der Fenton-Reaktion zu hochreaktiven Hydroxylradikalen (●OH) reagieren, die auf vielfältige Weise Zellen schädigen und den Zelltod induzieren können. Die Zelle und ihre Organellen werden durch biologische Membranen abgegrenzt, die sich in ihrer Permeabilität für H2O2 un- terscheiden. Aquaporine (AQP) sind wassertransportierende Transmembranproteine, wobei für einige Isoformen gezeigt werden konnte, dass sie neben Wasser auch den bidirektionalen Transport von H2O2 über zelluläre Membranen erleichtern. Die Rolle von AQP8 wurde in einem Insulin-produzierenden Zellmodell durch stabile AQP8-Überexpression (AQP8↑) und durch einen CRISPR/Cas9 vermittelten AQP8-Knockout untersucht. Es stellte sich heraus, dass AQP8 wesentlich für die Viabilität der insulinproduzierenden RINm5F-Zellen ist, so dass wir einen Tet-On-regulierten AQP8 Knockdown (AQP8 KD) etablierten. Aus diesen neu etablierten AQP8 überexprimierenden und knockdown Zellen ergibt sich u. a., dass AQP8 am H2O2 Transport durch die Plasma- und Mitochondrienmembran beteiligt ist und dass die AQP8 Expression durch proin- flammatorische Zytokine (in vitro) und in einem akut diabetischen Rattenmodel (in vivo) ansteigt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte proinflammatori- sche Zytokin-Toxizität auf einem gesteigerten oxidativen Stress in den Mitochondrien zurückzuführen ist, da H2O2 nicht effizient aus den AQP8 KD Zellen transportiert werden kann und zunehmend ●OH entstehen. Die Kaspase-Aktivität steigt daraufhin, was zu einer vermehrten Initiierung der Apoptose führt. Weiterhin ist ein Anteil der Toxizität auf Ferroptose zurückzuführen, was mit einer verringerten Stickstoffmonooxid (NO●) Konzentration zu erklären ist. Abschließend lässt sich sagen, dass AQP8 in der Plasma- und Mitochondrienmembran von insulin-produzierenden RINm5F Zellen lokalisiert ist und dort maßgeblich an dem H2O2 Transport beteiligt ist. In T1DM spielt AQP8 eine wichtige Rolle für einen Transport von H2O2 aus den Mitochondrien ins Zytosol, sodass die Konzentration in den Mitochondrien reduziert wird. Dies kann die Inaktivierung von H2O2 erleichtern.