Open Access

Kathrin Jeske

• More than half of the infectious diseases in humans are caused by zoonotic pathogens or pathogens of animal origin that were transmitted to humans a long time ago. Two important rodent-associated zoonotic pathogens are hantaviruses and human-pathogenic Leptospira spp. Both pathogens induce lifelong infection in the rodent hosts that shed the pathogen. Infection with these zoonotic pathogens in humans can cause clinical symptoms. Since some rodents, like the common vole (Microtus arvalis) and the bank vole (Clethrionomys glareolus syn. Myodes glareolus), have cyclic mass reproduction, this can result in years of population outbreaks in an increased number of disease cases in humans. This was found to be the case with the leptospirosis outbreaks in Germany and tularemia outbreaks in Spain, which were traced back to increased common vole density, as well as with the hantavirus disease outbreaks in several European countries, which were associated with bank vole population outbreaks. The aim of this work was to define the distribution and prevalence of different hantaviruses and leptospires as well as their coinfection in different European rodents, with a focus on voles from the genus Microtus and the identification of factors that affect the pathogen prevalence in rodent hosts. Therefore, common voles, bank voles, striped field mice (Apodemus agrarius) and other rodents were screened by molecular methods for the presence and prevalence of Leptospira spp. and different hantaviruses. Additionally, in selected studies, the presence of anti-hantavirus antibodies was screened by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using recombinant hantavirus-nucleocapsid proteins. The prevalence of hantavirus, Leptospira spp. and double-infections with both pathogens was analyzed using individual and population-based factors. Small mammals from four different European countries, Spain in the West, Germany and Austria in Central and Lithuania in Northeastern Europe, were included in the studies. With the molecular screenings, two new hantavirus strains were detected in continental Europe and were named Traemmersee hantavirus (TRAV) and Rusne hantavirus (RUSV) after the trapping locations in Germany and Lithuania, respectively. TRAV was detected in a field vole (Microtus agrestis) from the federal state of Brandenburg, Germany, while RUSV was detected in root voles (Microtus oeconomus) from Lithuania. Phylogenetic analysis of both hantaviruses indicates their close relation to Tatenale hantavirus and Kielder hantavirus, which were discovered in field voles in Great Britain. A pairwise evolutionary distance (PED) analysis showed that all four hantaviruses belong to the same hantavirus species, for which the putative name “Tatenale orthohantavirus” was proposed. Additionally, a recombinant RUSV antigen was generated and used successfully in ELISA for the detection of RUSV-specific antibodies and for the analysis of the cross-reactivity of monoclonal and polyclonal antibodies. In Germany, Tula orthohantavirus (TULV) was foremost detected in common voles in Thuringia and Brandenburg but was also detected in field voles in Brandenburg. Puumala orthohantavirus (PUUV) was detected in Thuringia at the virus distribution border, but sequences differed strongly from known sequences from another neighboring trapping location. While in Austria Dobrava-Belgrade orthohantavirus (DOBV), genotype Kurkino, was detected for the first time in striped field mice, no hantavirus RNA was detected in common voles from Spain. The cause of this absence in the Iberian common vole population might be its long-term isolation from the common vole populations more to the east. The TULV prevalence in Germany in this study was dependent on the season and on the prior growth of the reservoir population. An individual factor that affected the hantavirus prevalence, was the increasing age of the common vole. Leptospira spp.-DNA was detected in common voles from Spain and Germany, as well as in one striped field mouse from Austria. Except for the two detections of L. borgpetersenii in Spain, which were probably the result of spillover infections, only the genomospecies L. kirschneri was detected in common voles from Spain and Germany. The high prevalence of Leptospira spp., as well as the detection of only one genomospecies, confirm that L. kirschneri is the genomospecies for which the common vole is the main reservoir. Important factors for the Leptospira spp. prevalence were found to be, in addition to temperature and rainfall, the season and the preceding common vole density. Like the case with hantavirus, the age of the vole was found to be an influencing factor. In Germany, coinfections of TULV and Leptospira spp. were detected. These were associated with high common vole density and increased with the age of the common vole. Furthermore, the incidence of coinfections seems to be impacted more by the Leptospira spp. than by the hantavirus prevalence. As part of this thesis, TULV and PUUV were detected in previously untested regions in Germany, DOBV was detected for the first time in Austria and the distribution range of the putative species “Tatenale orthohantavirus” was extended to continental Europe for the first time with detection in two countries. Screenings in Spain indicate that certain common vole populations can be free from TULV infection. Furthermore, leptospires were detected in rodents from Spain, Germany and Austria. It was verified that certain Leptospira genomospecies are host-specific. Factors that influence the prevalence of infection or coinfection by hantaviruses and leptospires were determined. The origin and hosts associated with the Tatenale orthohantavirus should be clarified in further studies including the field vole and the root vole as well as other members of the genus Microtus in Europe and Asia. The development of a RUSV-antigen-based ELISA will enable future screening in humans and therefore might provide information about the human pathogenicity of this pathogen. For final confirmation of the zoonotic potential, isolation of the virus and development of a focus reduction neutralization test are necessary. The expansion of the striped field mouse to Austria and the detectable carryover of DOBV associated with this implies that further screening studies to more precisely characterize the distribution of DOBV (and other pathogens) are needed. The studies of DOBV spread in Austria as well as PUUV spread in Germany could help to better understand the emergence of zoonotic pathogens in new regions. The here described hantavirus-Leptospira spp. and Neoehrlichia mikurensis-Bartonella spp. coinfections should be further analyzed to characterize the interactions of the pathogens in the context of a microbiome and their influence on epidemiological aspects of the involved pathogens. The here identified individual and population-based impact factors for the TULV and Leptospira spp. prevalence should support the development and optimization of prediction models.
• Mehr als die Hälfte der Infektionskrankheiten des Menschen wird durch zoonotische Erreger, die vom Tier auf den Menschen übertragen werden oder vor langer Zeit vom Tier auf den Menschen übergegangen sind, hervorgerufen. Zwei bedeutende Nagetier-assoziierte Zoonoseerreger sind Hantaviren und humanpathogene Leptospiren. Beide Erregergruppen führen im Nagetierwirt zu einer lebenslangen Infektion und Ausscheidung des Erregers und können im Fehlwirt Mensch eine Erkrankung hervorrufen. Da einige Nagetiere, wie die Feldmaus (Microtus arvalis) und die Rötelmaus (Clethrionomys glareolus syn. Myodes glareolus), zyklische Massenvermehrungen zeigen, kann es in den Jahren der Massenvermehrung zur Zunahme der Erkrankungsfälle beim Menschen kommen. So wurden Leptospiroseausbrüche in Deutschland und Tularämieausbrüche in Spanien auf erhöhte Feldmausdichten und Hantavirus-Erkrankungsausbrüche auf Rötelmausmassenvermehrungen in verschiedenen westeuro¬päischen Ländern zurückgeführt. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung des Vorkommens und der Häufigkeit des Auftretens von verschiedenen Hantaviren und Leptospiren sowie deren Koinfektionen in unterschiedlichen europäischen Nagetieren mit besonderem Fokus auf Wühlmäuse der Gattung Microtus, und die Identifikation von Einflussfaktoren auf die Erregerprävalenz in den Nagetierwirten. Hierzu wurden Feldmäuse, Rötelmäuse, Brandmäuse (Apodemus agrarius) und andere Nagetiere mittels molekularer Verfahren auf das Vorkommen und die Prävalenz von Leptospira spp. und verschiedener Hantaviren untersucht. Für Hantaviren erfolgte zusätzlich bei ausgewählten Studien eine Antikörpertestung mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung rekombinanter Hantavirus-Nukleokapsidproteine. In die Untersuchungen wurden Kleinsäuger aus vier verschiedenen europäischen Ländern einbezogen: von Spanien im Westen, über Deutschland und Österreich in Mitteleuropa, bis hin zu Litauen im Nordosten. Im Rahmen der molekularen Untersuchungen wurden in Kontinentaleuropa zwei neue Hantavirusstämme entdeckt, die nach ihren Fangorten in Deutschland und Litauen als Traemmersee-Hantavirus (TRAV) und Rusne-Hantavirus (RUSV) bezeichnet werden. TRAV wurde in einer Erdmaus (Microtus agrestis) aus Brandenburg, Deutschland, entdeckt, während RUSV in der nordischen Wühlmaus (Microtus oeconomus) in Litauen detektiert wurde. Phylogenetische Analysen der beiden Viren zeigten deren nahe Verwandtschaft mit den in Großbritannien in Erdmäusen gefundenen Tatenale-Hantavirus und Kielder-Hantavirus. Eine Pairwise Evolutionary Distance (PED)-Analyse zeigte, dass diese Viren zu einer Hantavirusspezies gehören, für die der putative Name „Tatenale-Orthohantavirus“ vorgeschlagen wird. Vom RUSV wurde ein rekombinantes Antigen hergestellt und im ELISA erfolgreich für den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und die Analyse der Kreuzreaktivität von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern eingesetzt. In Deutschland erfolgte der Nachweis von Tula-Orthohantavirus (TULV) vorwiegend in Feldmäusen (in Thüringen und Brandenburg), aber in Brandenburg auch in Erdmäusen. Das Puumala-Orthohantavirus (PUUV) wurde in Rötelmäusen an der Virusverbreitungsgrenze dieses Virus in Thüringen detektiert, wobei sich die PUUV-Sequenzen stark von bereits vorher nachgewiesenen Sequenzen in Rötelmäusen von einem benachbarten Fangort unterschieden. Während in Österreich erstmals Dobrava-Belgrad-Orthohantavirus (DOBV), Genotyp Kurkino, in Brandmäusen nachgewiesen werden konnte, wurde in Feldmäusen aus Spanien keine Hantavirus-RNA detektiert. Für den fehlenden Nachweis von Hantavirus-RNA in der iberischen Feldmauspopulation könnte deren langanhaltende Isolation von Feldmäusen weiter östlich liegender Populationen die Ursache sein. Die TULV-Prävalenz war in dieser Studie in Deutschland von der Jahreszeit und, zeitlich versetzt, von der vorhergehenden Zunahme der Reservoirpopulation abhängig. Auf der Ebene des Individuums nahm die Hantavirus-Prävalenz mit dem Alter der Feldmaus zu. Leptospira spp.-DNA wurde in Feldmäusen in Spanien und Deutschland, sowie in einer Brandmaus in Österreich nachgewiesen. Bis auf zwei vermutlich durch Spillover-Infektion bedingte Leptospira borgpetersenii-Nachweise in Feldmäusen aus Spanien, wurde in Feldmäusen aus Spanien und Deutschland ausschließlich die Genomospezies Leptospira kirschneri detektiert. Die beobachtete hohe Prävalenz von Leptospira spp., sowie der ausschließliche Nachweis einer Genomospezies, bestätigten die Feldmaus als maßgeblichen Reservoirwirt für L. kirschneri. Als wichtige Einflussfaktoren für die Leptospira spp.-Prävalenz wurden neben Temperatur und Niederschlag auch Jahreszeit und vorhergehende Feldmausdichte ermittelt. Auf der individuellen Ebene wurde hier ebenfalls das Alter der Feldmäuse als Einflussfaktor ermittelt. In Deutschland wurden Koinfektionen von TULV und Leptospira spp. nachgewiesen. Diese sind bedingt durch erhöhte Feldmausdichte, sowie zunehmend mit dem Alter der Feldmaus. Darüber hinaus scheint die Leptospira spp.-Prävalenz für das Auftreten von Koinfektionen bedeutender als die TULV-Prävalenz. Im Rahmen dieser Arbeit konnten TULV und PUUV in bisher nicht untersuchten Gebieten in Deutschland, sowie DOBV erstmalig in Österreich nachgewiesen werden und das Verbreitungsgebiet der putativen Art „Tatenale-Orthohantavirus“ erstmals auf Festlandeuropa mit Nachweisen in zwei verschiedenen Ländern erweitert werden. Untersuchungen in Spanien deuten an, dass bestimmte Feldmauspopulationen auch frei von TULV-Infektionen sein können. Zudem wurden Leptospiren in Nagetieren aus Spanien, Deutschland und Österreich nachgewiesen und die Wirtsspezifität bestimmter Leptospirengenomospezies bestätigt. Für Hantaviren, Leptospiren und deren Koinfektionen wurden zudem Einflussfaktoren für deren Infektionshäufigkeit bestimmt. In weiterführenden Untersuchungen unter Einbeziehung von Erdmaus und der nordischen Wühlmaus sowie anderer Arten der Gattung Microtus in Europa und Asien sollte die Herkunft und Wirtsassoziation des Tatenale-Orthohantavirus aufgeklärt werden. Die Entwicklung eines RUSV-Antigen-basierten ELISAs wird im Rahmen zukünftiger Untersuchungen beim Menschen zur Aufklärung der Humanpathogenität dieses Erregers beitragen. Für eine finale Bewertung des Zoonosepotenzials dieses Virus ist jedoch die Virusisolierung und darauf basierende Entwicklung eines Fokusreduktionsneutralisationstests erforderlich. Die Einwanderung der Brandmaus in Österreich und die damit scheinbar verbundene Einschleppung des DOBV erfordert weitere gezielte Monitoringuntersuchungen, um die Ausbreitung des DOBV (und weiterer Erreger) genauer zu charakterisieren. Die Untersuchungen zur Ausbreitung von DOBV in Österreich und von PUUV in Deutschland könnten wichtige Hinweise liefern, um das Erstauftreten (Emergence) von Zoonoseerregern in neuen Gebieten besser zu verstehen. Die hier beschriebenen Hantavirus-Leptospiren- und Neoehrlichia mikurensis-Bartonella spp.-Koinfektionen sollten zukünftig genauer analysiert werden, um mögliche Interaktionen der Erreger unter Einbeziehung des Mikrobioms und deren Auswirkungen auf die Epidemiologie der beteiligten Erreger zu charakterisieren. Die hier identifizierten individuellen und Populations-basierten Einflussfaktoren für die TULV- und Leptospiren-Prävalenz sollten für die zukünftige Weiterentwicklung von Vorhersagemodellen und deren Optimierung herangezogen werden.