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Nils Möller

• Das alpha-Toxin (Hla) von Staphylococcus aureus (S. aureus) spielt eine bedeutende Rolle bei S. aureus-induzierten Pneumonien. Hla bindet zunächst als Monomer an die Plasmamembran eukaryotischer Wirtszellen und assoziiert sich zu heptameren Transmembranporen. Die Sensitivität gegenüber dem Toxin ist bei verschiedenen Atemwegsepithelzelllinien unterschiedlich ausgeprägt. Die Gründe dafür sind bis jetzt nicht vollends verstanden. Mögliche Faktoren, die einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen haben, könnten die Rezeptordichte und Effizienz der Porenbildung sowie die Entsorgung von Poren aus der PM durch Internalisierung und Degradation (lysosomal, proteasomal) oder durch Ausschleusung von extrazellulären Vesikeln in den Extrazellularraum sein. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung der Faktoren, die einen Einfluss auf die Toxin-Sensitivität von Wirtszellen haben könnten, am Beispiel der drei Atemwegs-Modellzelllinien 16HBE14o-, S9 sowie A549 genauer zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Menge an rHla, allem voran die Abundanz der Heptamere in der Plasmamembran der Zellen, einen starken Einfluss auf die Toxinsensitivität (gemessen an der Rate parazellulärer Lückenbildung in den Zellverbänden) der Zelllinien hat. Diese Ergebnisse korrelierten am besten mit der Häufigkeit des potenziellen Hla-Rezeptors ADAM10 in der Plasmamembran der drei Zelltypen, aber auch das Phospholipid Sphingomyelin scheint ebenfalls einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen zu haben. Die Zellgröße, der für die Hla-Vorpore stabilisierende Faktor Caveolin-1, Integrin α5β1 als weiterer möglicher Hla-Rezeptor und die Lipide Phosphatidylcholin/-serin zeigten dagegen keine Korrelation zur Hla-Sensitivität der drei Atemwegsepithelzelllinien. Das Lipid Phosphatidylethanolamin wies zwar das gleiche Muster wie das des Sphingomyelins bei den Zelllinien auf, jedoch muss eine mögliche Bedeutung des Lipids in der Hla-Bindung und/oder -Heptamerisierung erst noch untersucht werden. Untersuchungen der Internalisierung des Toxins zeigten, dass von den drei Atemwegsepithelzelllinien nur die S9-Zellen in der Lage waren die rHla-Heptamere effizient zu internalisieren. Dabei konnte unter Verwendung der rHla-Mutante rH35L, die keine Transmembranpore ausbilden kann, gezeigt werden, dass die Internalisierung der Toxin-Heptamere wahrscheinlich Poren-unabhängig geschieht. Durch die Überprüfung des rHla-Abbaus in S9-Zellen nach Inhibierung der lysosomalen oder proteasomalen Proteindegradation konnte ein Abbau des Toxins über das Proteasom ausgeschlossen werden. Dagegen scheint der lysosomale Weg von entscheidender Bedeutung für die Hla-Heptamer-Degradation zu sein. Eine saure Hydrolyse der Protease-resistenten Toxin-Heptamere in rHla-Monomere konnte allerdings nicht nachgewiesen werden und scheint somit bei dem lysosomalen Abbau keine Rolle zu spielen. Präparierte extrazelluläre Vesikel von rHla-behandelten S9-Zellen zeigten zudem, dass eine Entsorgung des Toxins über Exosomen und/oder Mikrovesikel ebenfalls bei diesen Zellen möglich zu sein scheint. Der primäre Weg der Hla-Prozessierung ist bei den S9-Zellen dennoch der lysosomale Abbau.
• The alpha-toxin (Hla) of Staphylococcus aureus (S. aureus) plays an important role in S. aureus-induced pneumonia. Hla initially binds as a monomer to the plasma membrane (PM) of eukaryotic host cells and associates with other monomers to form heptameric transmembrane pores. Sensitivity to the toxin varies among different airway epithelial cell lines. The reasons for this are not fully understood yet. Possible factors that might have an influence on the Hla sensitivity of cells could be the receptor density and efficiency of pore formation as well as the disposal of pores from the PM by internalization and degradation (lysosomal, proteasomal) or by shedding of extracellular vesicles into the extracellular space. The aim of this work was to investigate in more detail the relevance of factors that might have an influence on toxin sensitivity of host cells by using the three airway epithelial model cell lines 16HBE14o-, S9 as well as A549 as examples. It was shown that the amount of rHla, especially the abundance of heptamers in the PM, has a strong influence on toxin sensitivity (measured by the rate of paracellular gap formation in cell layers) of these cell lines. These results correlated best with the abundance of the potential Hla receptor ADAM10 in the PM of the three cell types, but the phospholipid sphingomyelin also appears to have an effect on the Hla sensitivity of these cells. In contrast, cell size, the Hla prepore stabilizing factor caveolin-1, integrin α5β1 as another possible Hla receptor, and the lipids phosphatidylcholine/-serine showed no correlation with Hla sensitivity. The lipid phosphatidylethanolamine showed the same pattern as that of sphingomyelin in these cell lines, but a possible role of this lipid in Hla binding and/or heptamerization remains to be investigated. Studies of the internalization of the toxin showed that of these three airway epithelial cell lines only the S9 cells were able to efficiently internalize rHla heptamers. By using the rHla mutant rH35L, which can’t form a transmembrane pore, it was shown that internalization of toxin heptamers probably occurs in a pore-independent manner. By examining the rHla degradation in S9 cells after inhibition of lysosomal or proteasomal protein degradation, degradation of the toxin via the proteasome could be excluded. In contrast, the lysosomal pathway seems to be of decisive importance for Hla heptamer degradation. However, acid hydrolysis of protease-resistant toxin heptamers into rHla monomers was not detected and thus does not seem to play a role in lysosomal degradation. Prepared extracellular vesicles from rHla-treated S9 cells also showed that disposal of the toxin via exosomes and/or microvesicles also appears to be possible in these cells. Nevertheless, the primary pathway of Hla processing in S9 cells is lysosomal degradation.