Open Access

Kevin P. Szillat

• Overall, the present thesis provides tools for virus characterization. Importantly, the application of the developed tools contributed to the fundamental knowledge of selected, veterinary relevant viruses in terms of their underlying biology and virus-host interaction. By using in vitro models and full-genome sequencing, important new findings were gained that contributed to the deeper understanding of the selected viruses. Results show that in vitro models can be successfully modified to enable study of specific host factors that are important for viral entry. By genetically modifying a bovine cell line using CRISPR/CAS9 technology , a stable cell culture model was established that is now available to the research community, to study the virus-host interaction of pestiviruses. The model was further used to elucidate the adaptability of bovine viral diarrhea the virus and impact on infectivity and growth. By using deep sequencing, genetic changes that occurred during the adaption process of bovine viral diarrhea virus were identified and linked to the phenotype, allowing the characterization of genetic regions important for virus binding to the host cell. Whole-genome analysis using deep-sequencing was further used to characterize circulating rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) strains from Germany. The study provides more than 50 full genomes of RHDV strains sampled between 2013 and 2020. Since the virus family is drastically under sampled, in particular in central Europe, these sequences represent a very valuable addition to the field. The investigation led further to the discovery of a novel recombinant virus strain in hares, that is likely still circulating today. This finding is of special interest, since it is the first detection of a recombination event between the genogroups RHDV and European brown hare syndrome virus (EBHSV) of Lagoviruses. It highlights the importance of full genome virus surveillance and the potential risk of virus variants that might evade diagnostic detection. Serological assay were used to study the persistency of antibodies developed during a natural infection with Schmallenberg virus. It could be shown that these antibodies are long lasting and therefore, re-emergence of this virus in Europe is likely favoured by introduction of naïve animals into a herd and not by decreasing antibody-titers over time. Overall, the discoveries described in this thesis underline the importance of adequate tools for virus characterization and they give valuable answers to fundamental questions regarding the biology of the different viruses.
• Die vorliegende Arbeit präsentiert besonders wichtige Werkzeuge, die zur Viruscharakterisierung genutzt werden können. Deren Anwendung hat im Rahmen dieser Studien zum grundlegenden Wissen über ausgewählte, veterinärmedizinisch relevante Viren in Bezug auf ihre Biologie und die Virus-Wirt-Interaktion beigetragen. Durch die Verwendung von in-vitro-Modellen und der Vollgenomsequenzierung wurden wichtige neue Erkenntnisse gewonnen, die zum tieferen Verständnis der ausgewählten Viren beitrugen. Die Ergebnisse zeigten, dass in vitro Zellsysteme erfolgreich mittels CRISPR/CAS9 Technologie genetisch modifiziert werden können, um die Untersuchung spezifischer Wirtsfaktoren zu ermöglichen, die z.B. für den Viruseintritt wichtig sind. Durch genetische Modifizierung einer Rinderzelllinie wurde hier ein stabiles Zellkulturmodell etabliert, das nun der Forschungsgemeinschaft zur Verfügung steht, um die Virus-Wirt-Interaktion von Pestiviren zu untersuchen. Das Modell wurde weiterverwendet, um die Anpassungsfähigkeit des Virus der bovinen Virusdiarrhöe und die Auswirkungen auf Infektiosität und Wachstum zu klären. Mit Hilfe von Vollgenomanalysen wurden genetische Veränderungen, die während des Anpassungsprozesses auftraten, identifiziert und mit dem Phänotyp der neuen Virusvarianten in Verbindung gebracht. Dies ermöglichte in der Folge die Charakterisierung genetischer Regionen, die für die Bindung des Virus an die Wirtszelle von besonderer Bedeutung sind. Vollgenomanalysen mit Hilfe des Next-Generation Sequencing wurden zudem zur Charakterisierung zirkulierender Stämme des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) aus Deutschland verwendet. Die Studie lieferte mehr als 50 vollständige Genome von Virusstämmen, die zwischen 2013 und 2020 beprobt wurden. Da zur Analyse der RHDV-Infektion insbesondere in Mitteleuropa drastisch zu wenig beprobt wird, stellen diese Sequenzen eine sehr wertvolle Ergänzung dar und erlauben erstmals eine molekulare Epidemiologie und umfassende genetische Stammanalysen. Die Untersuchungen führten weiter zur Entdeckung eines neuartigen rekombinanten Virusstamms bei Hasen, der wahrscheinlich noch heute im Umlauf ist. Diese Entdeckung ist von besonderem Interesse, da es sich um den ersten Nachweis eines Rekombinationsereignisses zwischen den verschiedenen Genogruppen RHDV und European Brown Hare Syndrome Virus (EBHSV) der Lagoviren handelt. Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung von Vollgenomanalysen und das potenzielle Risiko von Virusvarianten, die unter Umständen nicht mit den etablierten diagnostischen Methoden nachgewiesen werden können. Serologische Tests wurden zur Untersuchung der Persistenz von Antikörpern verwendet, die während einer natürlichen Infektion mit dem Schmallenberg Virus gebildet wurden. Es konnte gezeigt werden, dass diese Antikörper langlebig sind, so dass ein Wiederauftreten dieser Viren in Europa wahrscheinlich durch die Einführung naiver Tiere in eine Herde begünstigt wird und nicht dadurch, dass die Antikörpertiter mit der Zeit abnehmen. Insgesamt unterstreichen die beschriebenen Entdeckungen die Wichtigkeit adäquater Werkzeuge zur Viruscharakterisierung und geben wertvolle Antworten auf grundlegende Fragen zur Biologie der verschiedenen Viren.