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Solomon Abera Mekonnen

• The bacterium Staphylococcus aureus is a notorious pathogen that causes dangerous and difficult-to-treat infections. This applies especially to methicillin-resistant S. aureus, better known as MRSA. MRSA infections were originally associated with healthcare settings as a consequence of clinical antibiotic therapy. However, in recent years MRSA infections have become more common among healthy individuals in the community. The community-associated (CA-)MRSA lineages are generally more aggressive than hospital-associated (HA-) lineages. Therefore, it is alarming that such CA-MRSA lineages are now emerging in hospitals. This raises the fundamental question of how CA-MRSA adapts to this new niche. Further, since the originally distinguishing features of CA- and HA-MRSA are losing discriminative value, it is important from a healthcare perspective to identify novel distinctive markers for early recognition and elimination of hospital-adapted CA-MRSA. In the present PhD research, these challenges were tackled with a ‘multi-omics’ approach focused on the USA300 lineage of MRSA, originally identified as CA, but now also causing hospital outbreaks. The results show that hospital-adapted USA300 isolates produce an altered spectrum of virulence factors, changed their metabolism, and exploit human immune cells as a protective environment against antibiotics. Importantly, hospital-adapted CA-MRSA strains can be recognized through distinctive patterns of gene expression and secreted virulence factors. Altogether, these observations show that the epidemic behaviour of MRSA is a multi-factorial trait, and they provide new insights into the missing links between epidemiology and pathophysiology of S. aureus. Moreover, they highlight the benefits of multi-omics technologies for protecting patients and frail individuals against the aggressive CA-MRSA.
• In mehreren früheren Arbeiten wurden bereits die Mechanismen untersucht, die MRSA Stämme nutzen, um unseren Körper zu besiedeln und sich darin zu verbreiten oder um der Wirtsimmunantwort entkommen zu können5. Bis jetzt ist wenig über die molekularen Merkmale bekannt, die das epidemiologische Verhalten von CA- und HA-MRSA Stämmen erklären. Wie können diese zwei Klassen von MRSA Stämmen auf molekularer Ebene unterschieden werden? Dies ist nicht nur eine akademische Frage, sondern hat wichtige praktische Auswirkungen auf die Situation in Krankenhäusern wo besonders die hoch aggressiven CA-MRSA Stämme frühzeitig erkannt und eliminiert werden müssen, bevor sie schwere und kompliziert zu behandelnde Krankheiten verursachen können. Im Besonderen gilt dies für CA-MRSA Stämme, die bereits in Krankenhäusern identifiziert wurden und sich an ihre neue Umgebung anpassen. Dies wurde bereits für die USA300 MRSA Linie berichtet, welche ursprünglich in den USA als CA-MRSA entstand6, aber heutzutage auch in Krankenhäusern weltweit Infektionen auslöst 7–9. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden genomische, transkriptomische und proteomische Analyseverfahren genutzt, um die molekularen Anpassungen von USA300 Isolaten an die neue Krankenhausumgebung zu charakterisieren. Wie in Kapitel 2 beschrieben, ergab die vergleichende Genomanalyse von CA- und HA-USA300 Isolaten, dass die Unterscheidungsmerkmale überwiegend im variablen Bereich des Genoms zu finden sind. Zusätzlich ausgeführte Proteomanalysen der extrazellulären Proteinfraktion ergaben, dass die CA- und HA-Isolate anhand zwei verschiedener Proteingruppen voneinander getrennt werden können. Über diese zwei Proteingruppen lassen sich nicht nur die epidemiologischen Eigenschaften der USA300 Isolate, sondern auch das Wachstum und Überleben innerhalb von Epithelzellen vorhersagen10. Das Überleben innerhalb der Epithelzellen hat eine hohe Relevanz, da CA-MRSA Stämme typischerweise Haut- und Weichgewebeinfektionen verursachen, wobei die Epithelzellschicht die erste Barriere unseres Körpers darstellt, die überwunden werden muss. Faszinierenderweise unterscheiden sich die identifizierten Exoproteomgruppen in der Menge typischer zytoplasmatischer Proteine, was nahe legt, dass die sogenannten “moonlighting”-Proteine neue Unterscheidungsmerkmale von CA- und HA-USA300 darstellen können. “Moonlighting”-Proteine von Staphylokokken können während der Infektion verschiedene Funktionen in Abhängigkeit von der intra- oder extrazellulären Lokalisation erfüllen11,12. Zusammengefasst zeigten die Ergebnisse, das typische zytoplasmatische Proteine mit einer extrazellulären Lokalisation herangezogen werden können, um nah verwandte CA- and HA-USA300 Isolate voneinander zu unterscheiden. Die in Kapitel 2 aufgeführten Befunde motivierten zu einer umfassenden Untersuchung des zellulären Proteoms der CA- und HA-USA300 Isolate, die in Kapitel 3 beschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Anpassung der CA-USA300 Isolate an die Umgebungsbedingung im Krankenhaus zumindest teilweise im zentralen Kohlenstoffmetabolismus abspielt. Die Unterschiede, zwischen den zytoplasmatischen Proteinen in den CA- and HA-Isolaten bezogen sich hauptsächlich auf Glykolyse, Pentose-Phosphat-Weg, Glukoneogenese, Tricarbonsäure (TCA) Zyklus und den Stoffwechsel von Aminosäuren und Purinen. Dabei waren Glykolyse und Pentose-Phosphat-Weg in den HA-Isolaten vergleichsweise hochreguliert, wohingegen Gluconeogene, TCA Zyklus und Aminosäure- und Purinstoffwechsel in diesen Isolaten herunterreguliert waren. Diese unterschiedlichen Anpassungen der Stoffwechselwege passen bemerkenswerter Weise sehr gut zum klinischen Verhalten der beiden Isolatgruppen. HA-MRSA Stämme sind häufig für invasive Infektionen in geschwächten Individuen verantwortlich. In diesem Fall erreichen die Bakterien das Blut, wo Glukose, Aminosäuren und Purine von den Bakterien nicht neu synthetisiert werden müssen. Im Gegensatz dazu werden CA-Isolate eher in Haut- und Weichteilinfektionen gefunden. Dementsprechend müssen sich diese Bakterien auf eine Umgebung einstellen, in der Glucose, freie Aminosäuren und Purine nur begrenzt verfügbar sind. Diese Beobachtungen heben die Rolle des zentralen Kohlenstoffwegs für bestimmte Anpassungen hervor, die die Verbreitung von MRSA Stämmen in der Bevölkerung oder im Krankenhaus ermöglichen. Eine erfolgreiche Besiedlung und Invasion des menschlichen Wirts durch die Staphylokokken erfordert ebenfalls Anpassungen der Genexpression auf Transkriptionsebene. Um den Umfang der transkriptionalen Änderungen zwischen CA- und HA-USA300 Isolaten zu erfassen, wurde die in Kapitel 4 beschriebene RNAseq-Analyse durchgeführt. Zusammengefasst zeigen die RNAseq Ergebnisse spezifische Unterschiede zwischen den zwei Gruppen. Davon sind vor allem bestimmte Aktivitäten des sogenannten Agr quorum sensing Systems, sowie die Abwehr von oxidativem Stress und verschiedene biosynthetische Stoffwechselwege betroffen. Gene der Histidin-, Purin-, Pyrimidin- und Fettsäuresynthese wurden in beiden Isolatgruppen in verschiedenem Maße exprimiert. Weiterhin wurden Gene, die für S. aureus Virulenzfaktoren, wie Leukotoxine und Phenol-lösliche Moduline kodieren, welche für die Abwehr gegen das Wirts-immunsystem und das Überleben während der Phagozytose von Bedeutung sind, in den CA- und HA-isolaten unterschiedlich stark exprimiert. Besonders das Überleben während der Phagozytose durch Neutrophile ist wichtig für S. aureus, weil diese Immunzellen die erste Verteidigungsfront darstellen, sobald die Bakterien die primären Barrieren der menschlichen Haut oder Schleimhaut durchbrochen haben13. Daher wurde die Fähigkeit von CA- und HA-Isolaten eine Internalisierung von humanen Neutrophilen zu überleben, untersucht. Interessanterweise wurde eine verstärkte Abtötung der Neutrophilen bei den CA-Isolaten im Gegensatz zu den HA-Isolaten beobachtet. Dies deutete darauf hin, dass die Anpassung der HA-MRSA Stämme im Krankenhaus zumindest teilweise auf einen Schutz vor Antibiotikabehandlung durch verbessertes Überleben in den Neutrophilen und vermutlich auch anderen Zellen hinzielt. Diese Theorie wurde anschließend in einem Galleria mellonella Infektionsmodell bestätigt, in dem die HA-Isolate tatsächlich aufgrund des Überlebens innerhalb von Phagocyten besser vor einer Behandlung mit Gentamycin geschützt waren als die CA-Isolate. Ein besonders interessanter Befund war die unterschiedliche Expression von PSM Genen in den zwei Isolatgruppen. Zum Beispiel wiesen die CA-MRSA Stämme eine vergleichsweise geringere PSM Genexpression als die HA-MRSA Stämme auf. Dies war unerwartet, da vorherige Studien eine Bedeutung der PSMs für das Entkommen aus Neutrophilen beschrieben hatten14. Daher überprüften wir diese differentielle PSM Expression durch die Untersuchung des Resistenz gegen Daptomycin. Kürzlich wurde gezeigt, dass verringerte PSM Mengen S. aureus eine Resistenz gegen Daptomycin durch eine Abwehr mittels sezernierter Phospholipiden verleihen15. Daher vermuteten wir, dass CA-USA300 Isolate weniger empfindlich gegenüber Daptomycin wären als die HA-USA300 Isolate. Während das Wachstum der HA-MRSA Stämme tatsächlich verlangsamt war, wurde das Wachstum der CA-MRSA Stämme nicht von der Anwesenheit von Daptomycin im Kulturmedium beeinflusst. Hierbei muss erwähnt werden, dass Daptomycin ein Notfall-Antibiotikum ist und daher sehr selten zur Behandlung von S. aureus Infektionen eingesetzt wird. Daher kann die erhöhte Sensititvität von HA-Isolaten gegen Daptomycin als eine indirekte Folge ihrer Anpassungen an die Umgebung im Krankenhaus angesehen werden.