Strukturelle und funktionelle Untersuchung des lysosomalen integralen Membranproteins LIMP-2

Das lysosomale integrale Membranprotein Typ 2 (LIMP-2) wurde kürzlich als Transportrezeptor der lysosomalen Hydrolase β-Glucocerebrosidase (β-GC) identifiziert. Der Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion von LIMP-2 sowie die Interaktion mit β-GC ist bisher allerdings nicht näher untersucht worden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher den Einfluss der Glykosylierung auf Faltung, Strukturintegrität und Transport des LIMP-2 Proteins zu analysieren. Dies sollte erste Informationen hinsichtlich der LIMP-2 Struktur liefern. Verschiedene biochemische Methoden wie Mutagenese-Studien, Deglykosylierungs-experimente mit PNGaseF und EndoH sowie deren Auswertung mittels Western-Blot Techniken wurden dazu verwendet, um die Bedeutung einzelner potentieller N-Glykosylierungsstellen offenzulegen. Die lysosomale Lokalisation der entsprechenden LIMP-2 Glykosylierungsvarianten wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass neun der elf potentiellen N-Glykosylierungsstellen von LIMP-2 glykosyliert vorliegen. Sowohl die nicht konservierte N-Glykosylierungsstelle N122 als auch die unmittelbar vor der C-terminalen Transmembrandomäne gelegene N-Glykosylierungsstelle N430 werden nicht genutzt. Das LIMP-2 Protein selbst ist auf eine korrekte N-Glykosylierung angewiesen. Insbesondere eine Glykosylierung des Asparagins N68 ist essentiell, alleine aber nicht hinreichend. Der Glykosylierungsstatus von LIMP-2 und die beobachtete EndoH Sensitivität einzelner N-Glykosylierungsstellen stehen in keinem Zusammenhang mit der β-GC Interaktion. In weiteren Experimenten, unter anderem in Crosslink-Studien, konnte die Ausbildung eines LIMP-2 Homo-Dimers nachgewiesen werden. Weiterhin konnte für die Interaktion von LIMP-2 und β-GC ein 1:1 Verhältnis gezeigt werden. Die Überexpression der luminalen LIMP-2 Domäne als Sekretionsprotein in HEK-6E Zellen führte zur Ko-Sekretion endogener und ko-exprimierter β-GC. Neben einem nativen LIMP-2 / β-GC Komplex konnten zum Großteil nur artifiziell verknüpfte LIMP-2 / β-GC Komplexe gereinigt werden. Die Bedeutung der coiled-coil Domäne von LIMP-2 für die Vermittlung der β-GC Interaktion konnte durch die Präzipitation rekombinanter β-GC durch ein isoliertes LIMP-2 coiled-coil Peptid bestätigt werden. Abschließend konnte auch die Tertiärstruktur des coiled-coil Motives aufgeklärt werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse stellen somit die Grundlage für zukünftige Strukturanalysen dar, die dann zur vollständigen LIMP-2 Strukturaufklärung führen könnten.