Genotypisierung und Resistenzbestimmung des Hepatitis-B-Virus durch Pyrosequenzierung

Die Hepatitis B ist mit weltweit 320-400 Millionen chronisch-aktiv infizierten Menschen die häufigste Viruserkrankung. Die chronische HBV-Infektion kann zur Leberzirrhose und zum hepatozellulären Karzinom führen. Durch eine Therapie chronisch infizierter Patienten mit IFN-α sowie den Nukleosidanaloga Lamivudin, Adefovir-Dipivoxil oder Entecavir soll die Virusreplikation blockiert und damit die Häufigkeit der Spätfolgen reduziert werden. Die Kenntnis des HBV-Genotyps sowie bekannter Resistenz-Mutationen des Virusgenoms spielt eine große Rolle für eine erfolgreiche antivirale Therapie. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Routinediagnostik-Methode für die gleichzeitige Genotypisierung und Resistenzbestimmung von HBV zu etablie-ren. Dabei sollte die Technik der Pyrosequenzierung zum Einsatz kommen. Diese ermöglicht die Sequenzierung von kurzen Abschnitten von bis zu 100 Basenpaaren in Echtzeit und ist eine preisgünstige Alternative zur Sanger-Sequenzierung. Bei insgesamt 53 Patientenproben wurde ein Abschnitt der HBV-DNA-Polymerase durch Pyrosequenzierung und Sanger-Sequenzierung analysiert. Daraufhin wurden die Patientenproben genotypisiert und auf die bekannten Mutationen der Polymerase für Lamivudin- (rtM204V/I) und für Adefovir-Resistenz (rtA181V/T, rtN236T) sowie den kompensatorischen Mutationen für die Virus-Fitness (rtV173L, rtL180M) hin untersucht. Die Ergebnisse beider Methoden waren identisch. Parallel wurde eine Datenbank aus ca. 500 publizierten HBV-Sequenzen, vorrangig der Genotypen A und D, aufgebaut und mit dem NCBI-Algorithmus klassifiziert. Diese Datenbank diente der Auswertung der Sequenzen aus den Patientenproben. Die Pyrosequenzierung war also für die Bestimmung des Genotyps und der Resistenz-Mutationen genauso sensitiv wie die Sanger-Sequenzierung. Die Methode wurde schließlich im QCMD-Ringversuch validiert und steht der Routinediagnostik zur Verfügung.