Überexpression, Isolierung und Charakterisierung der bidirektionalen [NiFe] Hydrogenase des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803
Die bidirektionale [NiFe] Hydrogenase von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde mittels Affinitätschromatographie zu einer hohen Reinheit isoliert. Zu diesem Zweck diente ein an den C-Terminus der großen Diaphorase-Untereinheit (HoxF) fusionierter Strep-tag (II). Durch Insertion des psbAII-Promotors stromaufwärts der strukturellen Diaphorase-Hydrogenase-Gene (hoxEFUYH) und zusätzliche Expression der akzessorischen Gene (hypFCDEAB) von Nostoc sp. PCC 7120 unter der Kontrolle des psbAII-Promotors wurde die Synthese des Enzyms um ca. den Faktor 3 gesteigert und die Ausbeute der Isolierung erhöht. Damit ist das Vermögen der Überexpression des Enzyms in Synechocystis belegt. Im Isolat wurde eine unerwartete Stöchiometrie von HoxEFUYH im Verhältnis 0,2:2:2:1:1 detektiert. Zwei Formen des Enzym-Komplexes sind im nativen Gel sichtbar. Möglicherweise spiegelt dies den physiologischen Zustand wider oder die Isolierung führt zur Dissoziation des Komplexes. Die kleine und große Untereinheit der Hydrogenase (HoxYH) liegen in äquimolaren Mengen vor. Zum ersten Mal wurden Infrarot-spektroskopische Analysen einer [NiFe] Hydrogenase eines oxygenen phototrophen Bakteriums durchgeführt. Sie verdeutlichen, dass zwei CN- und ein CO-Ligand am Eisen des aktiven Zentrums gebunden sind. Vier verschiedene Redoxzustände des aktiven Zentrums wurden während der reversiblen Aktivierung und Inaktivierung identifiziert. Obwohl die detektierten Zustände denen der Standard [NiFe] Hydrogenasen ähnlich sind, konnte ein paramagnetisches Nickel weder im vollständig oxidierten noch im Nia-C Zustand der Katalyse mittels ESR-Spektroskopie detektiert werden. Ein weiterer Unterschied zu den Standard Hydrogenasen ist, dass das Enzym unter oxischen Bedingungen nur einen inaktiven Zustand aufweist. Die stark oxidierte Vorstufe, namentlich Niu-A, kommt in der Hydrogenase von Synechocystis nicht vor. Dies ist ein erster Hinweis auf die Hintergründe des schnellen Reaktivierungsvermögens der Hydrogenase von Synechocystis. ESR- und UV/VIS-Spektroskopie bestätigten die auf Sequenzebene vorhergesagte Präsenz von [4Fe4S], [2Fe2S], 2[4Fe4S] Clustern sowie FMN. Dagegen konnte kein [3Fe4S] Cluster, wie in Standard Hydrogenase üblich, identifiziert werden. Dies scheint, genauso wie die Abwesenheit von paramagnetischem Nickel in der ESR-Spektroskopie ein generelles Phänomen der bidirektionalen [NiFe] Hydrogenasen, die mit einer Diaphorase assoziiert sind, zu sein. Kristallisierungsversuche des Enzyms führten zu ersten interessanten Konditionen und zur Optimierung der Isolierungsstrategie. Beides bildet die Grundlage für weitere Versuche zur Gewinnung von großen Einkristallen. Bedingungen zur Bildung eines aktiven Hydrogenasefilms auf einer Pyrolytischen Graphit Kanten (PGE)-Elektrode wurden etabliert, die viele Untersuchungen zur katalytischen Umsetzung des Enzyms ermöglichen. Erste elektrochemische Analysen zeigen das pH-Optimum der Katalyse und dass das Enzym von Synechocystis eine für die Klasse der [NiFe] Hydrogenasen außergewöhnliche Direktionalität hin zur H2-Produktion aufweist. Diese Tatsache verdeutlicht, genauso wie die geringe O2 Empfindlichkeit, das biotechnologische Potenzial des Enzyms.
The bidirectional [NiFe] hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 was isolated to high purity by a single affinity chromatography step using a Synechocystis mutant with a Strep-tag II fused to the C-terminus of HoxF. To increase the yield of purified enzyme the psbAII-promoter was inserted upstream of the structural diaphorase-hydrogenase genes (hoxEFUYH). In addition, the accessory genes (hypFCDEAB) from Nostoc sp. PCC 7120 were expressed under the control of the psbAII-promoter. In the respective strain the synthesis of active hydrogenase was about 3 fold higher compared to the wild type, proving the overexpression capacity of the hydrogenase in Synechocystis. The detected subunit stoichiometry of the isolated enzyme was 0,2:2:2:1:1 for HoxEFUYH. Two hydrogenase complexes occur in a native gel. Taken together, these are surprising findings that, either represent the physiological state or arise due to dissociation during the purification procedure. The small and large subunits of the hydrogenase (HoxY and HoxH) occur in equimolar amounts. For the first time a Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopic characterization of a [NiFe] hydrogenase from an oxygenic phototroph is presented, revealing that two cyanides and one carbon monoxide coordinate the iron of the active site. Four different redox states of the active site were detected during the reversible activation/inactivation. Although these states appear similar to those observed in standard [NiFe] hydrogenases, no paramagnetic nickel state could be detected in the fully oxidized form and the Nia-C form by means of EPR-spectroscopy. Another difference to standard hydrogenases is the fact that the enzyme from Synechocystis only exhibits one inactive state under oxic conditions. The most oxidized state, namely Nia-U, is absent, causally determining its fast reactivation capacity. Catalytic amounts of NAD(P)H are sufficient to activate the reaction of this enzyme with hydrogen. UV/VIS- and EPR-spectroscopy confirm the presence of a [4Fe4S], [2Fe2S] and 2[4Fe4S] cluster as well as a FMN. On the contrary no [3Fe4S] Cluster, as observed in standard hydrogenases, could be identified. This characteristic and the absence of any paramagnetic nickel signal in EPR-spectroscopy seem to be common features in bidirectional [NiFe] hydrogenases associated with a diaphorase. Attemps to crystalize the enzyme have led to interesting initial conditions and to the optimization of the purification process. Both of these advances provide a basis for further assays to obtain large mono-crystals. Conditions to form an active film of hydrogenase on a pyrolytic graphite edge (PGE) electrode surface were established. This will permit investigation of the catalytic turnover of the enzyme. First electrochemical experiments determine the pH-optimum for the catalysis and show an outstanding bias towards hydrogen production for the hydrogenase from Synechocystis in contrast to other [NiFe] hydrogenases which prefer hydrogen consumption. This and the less oxygen sensitive character of the enzyme demonstrate it´s biotechnological potential.
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