Charakterisierung der für die Reifung der Hydrogenase und anderer Metall-Enzyme von Synechocystis sp. PCC 6803 zuständigen Gene

In der vorliegenden Arbeit wurde die Reifung der bidirektionalen [NiFe]-Hydrogenase durch Deletionsmutanten der akzessorischen Gene von Synechocystis sp. PCC 6803 untersucht. Hydrogenaseaktivitätsmessungen der Deletions- und Insertionsmutanten von hypA1 (slr1675), hypA2 (sll1078), hypB1 (sll1432), hypB2 (sll1079), hypC (ssl3580), hypD (slr1498), hypE (sll1462), hypF (sll0322) und hoxW (slr1876) haben gezeigt, dass alle diese für die Hyp-Proteine kodierenden Gene, bis auf hypA2- und hypB2, essentiell für die Prozessierung der Hydrogenase sind. Komplementationsmutanten konnten zusätzlich zeigen, dass dieser Phänotyp nicht auf polaren Effekten der Deletionen beruht. Die Transkription der Hydrogenase ist in den Mutanten nicht betroffen und schliesst daher ihre Regulation über die hyp-Gene aus. Das Enzym wird nicht mehr korrekt assembliert und zeigt deswegen in den Deletionsmutanten keine Aktivität mehr. Des weiteren konnte für die Homologen von hypA und hypB gezeigt werden, dass diese sich nicht gegenseitig komplementieren können. Die Hydrogenaseaktivität für die hypA1- und die hypB1- Deletionsmutanten konnte mit steigender Nickel-Konzentration angehoben werden, daher haben die Proteine HypA1 und HypB1 wahrscheinlich die gleiche Funktion der Insertion von Nickel ins aktive Zentrum in Synechocystis wie ihre Homologen in E. coli. Die HypA- und HypB-Proteine haben keine Funktion in der Reifung der Urease, wie es in Helicobacter pylori der Fall ist (Olson et al., 2001). Es kann aufgrund der Ergebnisse davon ausgegangen werden, dass die Hyp-Proteine, mit Ausnahme von HypA2 und HypB2, die gleichen Funktionen innehaben wie ihre Homologen in E. coli. Ein Komplex aus HypC und HypD bindet das Eisen, HypE und HypF sind für die Anlagerung der anorganischen Liganden Kohlenmonoxid und zwei Cyaniden zuständig, HypA1 und HypB1 inserieren das Nickel-Ion ins aktive Zentrum und HoxW spaltet als Protease den C-Terminus ab (abgeleitet aus Blokesch et al., 2002). Dadurch wird die prozessierte große Untereinheit der Hydrogenase HoxH erhalten, die sich dann mit der kleinen Untereinheit zusammenlagern kann und das aktive Enzym herstellt. Des weiteren wurde eine Mutante von Synechocystis sp. PCC 6803 hergestellt, in der das Protein HypX aus Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) exprimiert wurde. HypX fügt in Cupriavidus necator einen zusätzlichen Cyanid-Liganden an das Nickel im aktiven Zentrum an. Die Mutante zeigte jedoch keine gesteigerte Hydrogenaseaktivität und Stabilität. Es wurden Metalltransporter charakterisiert, und zwar konnte für HupE gezeigt werden, dass dieser Transporter vor allem für den Cobalt-Transport in die Zelle zuständig ist, allerdings unspezifisch auch einen geringen Anteil an Nickel transportiert. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass das Cobalt für die Methionin-Synthase benötigt wird. Daraufhin konnte bewiesen werden, dass das cbi-Gencluster für einen Nickel-Transporter kodiert, der für die Hydrogenase essentiell ist. Durch die Aufreinigung des Proteins SpeB2 konnte es als im Arginin-Abbauweg beteiligt charakterisiert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass es 4-Guanidinobutyrat und Arginin umsetzen kann. Da die Aktivität des Proteins um 60 % gesteigert werden konnte, wenn es mit HypA2 und HypB2 exprimiert wurde, konnte nachgewiesen werden, dass diese beiden Proteine für die Assemblierung des SpeB2 zuständig sind. Weiterhin wurde Mangan als das Metall im aktiven Zentrum identifiziert.