Molekulare Grundlagen der proteolytischen Freisetzung von TNF-alpha und Fas Ligand durch ADAM-Proteasen

Der Fas Ligand ist als Apoptose-induzierendes Molekül auf der Oberfläche von T-und NK-Zellen, einigen Tumorzellen sowie Zellen immunpreviligierten Gewebes beschrieben. Die proteolytische Freisetzung des humanen Fas Liganden trägt zur negativen Regulation der apoptotischen Aktivität dieses Todesliganden bei. Obwohl ein erhöhtes Serumlevel des löslichen Fas Liganden mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert erscheint, ist die Fas Ligand-freisetzende Protease bisher nicht identifiziert worden. In dieser Arbeit konnte durch pharmakologische, biochemische und genetische Analysen die Metalloprotease ADAM10 als diejenige Protease identifiziert werden, die in kritischer Weise das Shedding des Fas Liganden vermittelt. Dabei konnte die essentielle Bedeutung von ADAM10 als Fas Ligand Sheddase sowohl in Mausfibroblasten als auch in humanen epithelialen und hämatopoetischen Zellen gezeigt werden. Eine Verstärkung der Fas Ligand-vermittelten Zytotoxizität von Tumorzellen durch spezifische ADAM10-Inhibition konnte nachgewiesen werden. Somit könnte eine Fehlregulation der ADAM10-Aktivität in Tumorzellen eine Rolle im sogenannten „tumor counterattack“ spielen. Darüber hinaus konnte durch ADAM10-Inhibition im Fas Ligand-abhängigen aktivierungsinduzierten Zelltod von T-Zellen eine erhöhte Apoptoserate erreicht werden. Daher könnte die ADAM10-Aktivität einen bedeutsamen Beitrag zur Regulation des aktivierungsinduzierten Zelltods leisten. Aufgrund von Untersuchungen zur Regulation des Sheddings des Fas Liganden erscheinen eine Abhängigkeit des FasL-Sheddings von der Fas-Rezeptorbindung sowie die Endozytose von Oberflächen-FasL unwahrscheinlich. Dafür legt das Prozessierungsmuster von inaktiven humanen Fas Ligand-Mutanten nahe, dass der Fas Ligand als Trimer abgespalten werden könnte. Analysen zur Vermittlung der Substratspezifität wurden mit Hilfe von chimären ADAM10/ADAM17 Proteasen durchgeführt, in denen verschiedene Domänen von ADAM10 gegen die entsprechenden Domänen der homologen Protease ADAM17 (TACE), die den FasL nicht proteolytisch prozessieren kann, ausgetauscht wurde. Hier zeigte sich eine Beteiligung aller Domänen von ADAM10 an der spezifischen proteolytischen Prozessierung des humanen Fas Liganden. Dabei sind die extrazellulär gelegenen Domänen sowie die Transmembrandomäne essentiell, die zytoplasmatische Domäne von ADAM10 trägt lediglich einen Teil zur Spezifität des Fas Ligand-Sheddings bei. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit mithilfe von ADAM10/ADAM17 doppeldefizienten Mausfibroblasten gezeigt werden, dass ADAM10 den humanen TNF- effektiv konstitutiv, nicht jedoch PMA-stimulierbar freisetzen kann. Die Untersuchungen zur Regulation und Spezifität des humanen TNF--Sheddings mit Hilfe der ADAM10/ADAM17 Chimären führten zu der Identifizierung einer funktionellen Einheit aus Transmembrandomäne und Disintegrin-/cysteinreicher Domäne von ADAM17, die das PMA-stimulierte Shedding des humanen TNF- vermittelt. In dieser Arbeit wird erstmals die mögliche Rolle der Transmembrandomänen von ADAM10 und ADAM17 bei der Vermittlung der Regulation und Spezifität des Sheddings beschrieben. Einen möglichen Einfluss der Transmembrandomäne auf die Konformation oder Orientierung der cystein¬reichen Domäne, die in vielen Untersuchungen als notwendig für die Substrat¬erkennung durch ADAMs beschrieben worden ist, wäre denkbar. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind allerdings noch unklar und sollen Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.