Characterization and Genetic Improvement of Lactobacilli for Application in Probiotic Dairy Products
Lactobacilli have a worldwide industrial use as starters in the manufacturing of fermented dairy products. Moreover, some Lactobacillus strains have probiotic characteristics leading to increasing the use of lactobacilli in fermented food products. Increasing of probiotic lactobacilli in food products and nutritional supplements underscores the need to evaluate and correctly identify these useful bacteria. The aims of this study were to evaluate putative probiotic lactobacilli isolated from different sources as fermented milk products from Egypt and faeces from two new born children (twins) for establishment of probiotic strains, to clone and transform a bile salt hydrolase gene for genetic improvement of Lactobacillus strains to act as probiotics. Chapter I of the present study deals with for identification of LAB using molecular methods, like e.g. ARDRA, PFGE, and sequencing of the 16S rRNA gene, to achieve accurate identification for selection of probiotics. The objectives of chapter II were evaluation and characterization of 26 Lactobacillus strains through probiotic selection criteria (acid tolerance, bile salts resistance and antimicrobial activity). Also, a safety assessment of some Lactobacillus isolates was done. We report a survey of susceptibility of 26 Lactobacillus against 13 antibiotics including inhibitors of cell wall synthesis, protein and nucleic acid synthesis. Resistance to bile salts is one of the important criteria for selection and establishment of probiotic strains with good health benefits. Most of Lactobacillus strains showed some resistance to bile salts. In chapter III, we describe that conjugated bile salt hydrolase gene (cbh) is responsible for de-conjugation of bile acids. The cbh-gene and its regulatory sequences (promoter, ribosomal-binding site and terminator) from highly bile salts resistance Lactobacillus plantarum BfEL 92122 strain were amplified by PCR, cloned into E. coli vectors. The cbh was so strongly expressed in E. coli that transformants could be identified directly on indicator plates containing bile salts as a substrate, indicating that the cbh gene might be generally useable as a food-grade indicator gene. Cbh was recloned into several E. coli/Lactobacillus shuttle vectors. Electrotransformation of L. gasseri, L. casei and L. rahmnosus strains with these recombinant plasmids and expression of cbh gene significantly improved resistance against ox-gall, glycodeoxycholic- and taurodeoxycholic acid. For probiotic bacteria to survive in the product and after consumption in the consumer’s gastrointestinal tract, inhibitory effect of bacteriophages and autolysis during industrial fermentation should be also considered. Therefore, chapter IV focused on lysogeny and autolysis of lactobacilli caused by bacteriophages or their enzymes and the characterization of a bacteriophage, phi Lbgas1.from L. gasseri. The establishment of a prophage cured derivative of this strain is reported. Finally, we purpose for completion of characterization prospective in vivo studies on survival of Lactobacillus strain in animal models (like e.g. Gottingen minipigs). These studies may then form the basis for clinical evaluation the potential of the selected strains. health properties
Lactobacillen werden weltweit für die Herstellung fermentierter Lebensmittel benutzt. Neben ihrer Eignung als Säuerungsorganismen besitzen einige Stämme der Lactobacillen probiotische Eigenschaften. Um Bakterien als Probiotica nutzen zu können, ist eine korrekte Identifizierung und Evaluierung dieser Stämme unumgänglich. Das Ziel dieser Studie war es deshalb eventuell probiotische Lactobacillen-Stämme unterschiedlichster Herkunft (fermentierte Milchprodukte aus Ägypten, Fäzes von zwei neugeborenen Zwillingen) zu charakterisieren. Durch Klonierung und anschließender Übertragung eines Gens für eine Gallensalz- Hydrolase wurde zudem versucht, die probiotischen Eigenschaften einiger Stämme von Lactobacillen zu verbessern. Kapitel I dieser Arbeit befasst sich mit der exakten Identifizierung von 26 Lactobacillus-Isolaten mittels molekularbiologischer Methoden wie ARDRA, PFGE und Sequenzierung von 16S rRNA Genen. In Kapitel II werden probiotische Eigenschaften dieser Stämme, wie Säure- und Gallensalztoleranz sowie deren antibakteriellen Aktivitäten und ihre Empfindlichkeiten gegenüber 13 Antibiotika beschrieben. Resistenz gegen Gallensalze ist ein wichtiges Kriterium für die Selektion und die Etablierung von probiotischen Stämmen. Die meisten der untersuchten Stämme zeigten eine gewisse Basistoleranz gegenüber Gallensalzen. Um dies zu erhöhen wurde das Gen cbh für eine Gallen salz hydrolase (conjugated bile salt hydrolase) aus Lactobacillus plantarum kloniert und in verschieden Lactobacillus-Spezies transformiert. Das cbh-Gen und seine regulatorischen Sequenzen (Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle, Terminator) wurden mittels PCR amplifiziert und in E. coli Klonierungsvektoren eingebaut. In E. coli wurde das Gen solchermaßen stark exprimiert, dass eine direkte Identifizierung transformierter Zellen möglich war. Das Gen eignet sich daher als ein „Food-Grade“ Indikator Gen. Das cbh-Gen wurde anschließend in verschieden E. coli/Lactobacillus Shuttle-Vektoren rekloniert und in verschiedenen Lactobacillus Spezies (L. casei, L,. gasseri, L. rhamnosus) exprimiert. Die Hydrolaseaktivität führte immer zu einer signifikanten Erhöhung der Resistent transformierter Stämme gegen Ochsengalle sowie Glyco- und Taurodeoxicholsäure. Wichtig für das Überleben probiotischer Bakterien im Produkt und im Verdauungstrakt des Konsumenten sind deren Verhalten gegenüber Bakteriophagen sowie ihre autolytischen Aktivitäten. In Kapitel IV werden Fragen zur Lysogenie und Autolyse einiger Lactobacillen Stämme beantwortet. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde ein temperenter Bacteriophage, phiLbgas1, aus L. gasseri isoliert und charakterisiert, sowie ein prophagenfreies Derivat dieses Stammes hergestellt. Für eine abschließende Bewertung der untersuchten Stämme als Probioticum sind in-vivo Studien zum Überleben dieser Stämme in einem tierischen Modell wie z.B. in Göttinger Minischweinen geplant. Die Ergebnisse solcher Studien könnten die Basis bilden für eine anschließende Evaluierung potentieller, gesundheitsfördernder Eigenschaften ausgewählter Stämme.
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