Expression, Purification and Biophysical Characterizationof Pestiviral Autoprotease NS2 and Sorghum bicolor Deoxyhypusine/Homospermidine Synthase
The first part of this thesis focuses on the ER membrane-integrated autoprotease non-structural protein 2 (NS2) of the bovine viral diarrhea virus (BVDV). This virus is a close relative of hepacivirus C (HCV) and the causative agent behind two associated, economically very important diseases of livestock breeding: bovine viral diarrhea (BVD) and mucosal disease (MD). For the treatment and eradication of BVDV, NS2 is a highly valuable drug target. In this thesis, two common expression systems – prokaryotic Escherichia coli and eukaryotic insect cells – were applied to identify optimal conditions for the expression of full-length or truncated variants of the NS2 suitable for future structure determination experiments. The deoxyhypusine synthase (DHS) and its paralog homospermidine synthase (HSS) from Sorghum bicolor have been intensively studied in the second part of this thesis. The DHS enzyme catalyzes the NAD+-dependent deoxyhypusination of a single specific lysine residue of eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF-5A) as the first of two modification steps in the synthesis of the unique amino acid modification hypusine. During evolution, several independent duplications of the conserved DHS gene allowed the congruent development of paralogous HSS in different lineages of flowering plant. In many of these lineages, the HSS became the first specific enzyme of the pyrrolizidine alkaloid biosynthesis pathway, which produces defensive substances as protection against herbivores. In this thesis, two S. bicolor DHS isoforms and their HSS paralog were characterized with several different biophysical techniques to gain deeper insights into their differences and common features.
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der ER-Membran-integrierten Autoprotease non-structural protein 2 (NS2) des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus (BVDV). Dieses Virus ist eng verwandt mit dem Hepacivirus C (HCV) und ist der Erreger zweier miteinander in Beziehung stehender, ökonomisch bedeutsamer Krankheitsbilder in der Rinderzucht: der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD) und der Mucosal Disease (MD). NS2 ist dabei ein interessantes Ziel für die Entwicklung von Wirkstoffen, die in der Behandlung und Ausrottung des BVD-Virus verwendet werden können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei beliebte Expressionssysteme eingesetzt – der Prokaryot Escherichia coli und eukaryotische Insektenzellen –, um die optimalen Bedingungen für die heterologe Expression der NS2-Autoprotease zu identifizieren, die anschließend für die Strukturbestimmung eingesetzt werden können. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Desoxyhypusin-Synthase (DHS) und die paraloge Homospermidin-Synthase (HSS) aus Sorghum bicolor eingehend biophysikalisch untersucht. Das homotetramere DHS-Enzym katalysiert die NAD+-abhängige Desoxyhypusinierung eines einzigen spezifischen Lysinrests des eukaryotischen Translations-Initiationsfaktors 5A (eIF-5A). Dies stellt den ersten von zwei Schritten in der Synthese der einzigartigen Aminosäure Hypusin dar. Im Verlauf der Evolution konnte sich aufgrund von Duplikationen des konservierten DHS-Gens in einer Reihe von Blühpflanzen-Familien mehrmals unabhängig voneinander aus dem DHS-Enzym die paraloge HSS entwickeln. Das HSS-Enzym hat sich auf eine Nebenreaktion der ursprünglichen DHS spezialisiert und besitzt keine DHS-Aktivität mehr. In vielen Blühpflanzen-Familien wurde die HSS zum Schlüsselenzym des darauf aufbauenden Pyrrolizidinalkaloid-Biosyntheseweges, der Abwehrsubstanzen zum Schutz vor Fraßfeinden produziert. In dieser Arbeit wurden zwei DHS-Isoformen und ihr HSS-Paralog aus S. bicolor mit verschiedenen biophysikalischen Techniken näher charakterisiert, um einen besseren Einblick in ihre Unterschiede und gemeinsamen Eigenschaften zu erhalten.
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