Transportmechanismus und Selektivität der Formiat-Nitrit-Transporter
Formiat-Nitrit-Transporter (FNT) sind in Mikroorganismen für den Transport von kleinen monovalenten Anionen zuständig und somit Schlüsselstoffe im Energiemetabolismus. Vor kurzem wurde der Plasmodium falciparum FNT als entscheidender Laktattransporter des Malariaparasiten identifiziert. FNTs werden als potentielle Wirkstoffziele gegen mikrobielle Infektionen betrachtet. FNT-Kristalldaten zeigen einen Transportpfad mit zwei lipophilen Konstriktionen, welche ein konserviertes Histidin einschließen. Ziel dieser Arbeit war das Beantworten der Frage, ob und wie Anionen protoniert werden, um die lipophilen Engstellen passieren zu können. Weiterhin wurde die Substratselektivität von eukaryotischen und prokaryotischen FNTs untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit erkannten bioinformatische und funktionelle Untersuchungen einen Substratselektivitätsfilter, welcher sich oberhalb der extrazellulären Konstriktion befindet und über einen Größenausschluss selektiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich der Selektivitätsfilter evolutionär von prokaryotischen zu eukaryotischen FNTs erweitert hat, um sich den metabolischen Anforderungen anzupassen. Die untersuchten FNTs wiesen pH-abhängige Transportprofile auf. Messungen belegten einen Substrat-Protonen-Symport und bestätigten einen einfachen Protonierungsschritt für die Substratneutralisierung. Die elektrostatische Anziehung des Substratanions konnte einem konservierten Lysin im Poreneingang zugewiesen werden. Durch mathemathische Modelle und Solvationssimulationen wurden pKS-Verschiebungen des Substrates aufgrund einer veränderten dielektrischen Umgebung im Protein bestimmt. Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte folgendes Mechanismus-Modell erstellt werden: 1. Elektrostatische Anziehung des Substratanions zum FNT, 2. gleichzeitige dielektrische Verschiebung der Substratazidität, welche zur Neutralisation bedingt durch einen Proton-Transfer des Bulkwassers führt, 3. Passage des neutralen Substrates durch die lipophilen Engstellen.
Formate-nitrite transporters (FNT) regulate the flow of small monovalent acids and are therefore key regulators of the energy metabolism of microorganisms. The eukaryotic FNT of Plasmodium falciparum was recently identified as the malaria parasite’s crucial lactate transporter. FNTs are being considered as potential drug targets for treating microbial infections. Crystal data of FNTs revealed that two hydrophobic constrictions occlude the transport path, which enclose a conserved histidine. The objective of this work was to clarify, whether and how substrate anions become protonated for passing the hydrophobic constrictions. Furthermore, it was intended to investigate the substrate selectivity of eukaryotic and prokaryotic FNTs. Bioinformatic and functional experiments revealed a substrate selectivity filter, which is located above the extracellular constriction and selects by exclusion. It was confirmed that the eukaryotic selectivity filter is widened compared to the prokaryotic filter due to evolutionary changes in metabolic needs. FNTs revealed a pH-dependent transport profile. Measurements showed a substrate/proton symport and indicated a single protonation step for neutralization. The electrostatic attraction of substrate anions could be assigned to an invariant lysine in the extracellular pore entrance. Mathematical models and solvation simulations were used to identify shifts of substrate acidity as a result of a changed dielectric environment in the protein. Based on these new insights, the following model of FNT transport mechanism was established: 1. Electrostatic attraction of substrate anions to the FNT, 2. simultaneous dielectric shift of substrate acidity leading to neutralization by means of proton transfer from the bulk solvent, 3. passage of the neutral substrate via the lipophilic constrictions.
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