Untersuchung des Calcineurin-NFAT Signalweges mittels eines „miRNA-Hochdurchsatz-Screens“ in einer murinen Myoblastenvorläuferzelllinie

Harazin, Violetta

VolltextDissertation2016Public AccessUrhG

Untersuchung des Calcineurin-NFAT Signalweges mittels eines „miRNA-Hochdurchsatz-Screens“ in einer murinen Myoblastenvorläuferzelllinie

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, systematisch neue miRNA Modulatoren des Calcineurin-NFAT Signalweg zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde ein „miRNA Screen“ entwickelt und getestet. Die Durchführung des „Screens“ erfolgte in einer murinen Myoblastenvorläuferzelllinie, die eine Luziferase Expressionskassette unter der transkriptionellen Kontrolle von vier NFAT Enhancer Elementen enthielt. Bei der Analyse des „miRNA-Screens“ wurde der Einfluss von 1050 miRNA Mimics und 624 miRNA LNA™ Inhibitoren auf den Calcineurin NFAT Signalweg untersucht. Es wurden zehn miRNA Mimics ausgewählt, die einen signifikanten Einfluss im Calcineurin-NFAT Signalweg aufwiesen. Der Einfluss dieser zehn miRNA Modulatoren auf die NFAT-Aktivität wurde weiter in der Primärkultur der neonatalen ventrikulären Rattenkardiomyozyten untersucht. In beiden Zellsystemen konnte der gleiche Einfluss der Hochregulation der NFAT-Aktivität mit der miRNA-142-5p ermittelt werden, die für weitere in vitro und in vivo Charakterisierungen ausgewählt wurde. Weiterführende Versuche zeigten, dass die miRNA-142-5p die Phenylephrin-induzierten hypertrophen Effekte in kultivierten Kardiomyozyten verringert. Die negative Regulation der Hypertrophie durch die miRNA-142-5p steht im Widerspruch zu der Modulation im Calcineurin-NFAT Signalweg und geht auf den Mechanismus der MAP-Kinase Aktivität und des Zielgens p300 zurück. Der miRNA-142-5p konnte eine bedeutende Rolle der Regulation in Mausmodellen durch transversale Aortenkonstruktion (TAC) und LAD Ligatur (Myokardinfarkt) zugeschrieben werden. Um den Einfluss der miRNA-142-5p auf die kardiale Hypertrophie in vivo zu prüfen, wurde eine transgene Mauslinie generiert, die die miRNA 142-5p herzspezifisch überexprimiert. Die transgenen miRNA-142 Mäuse zeigten eine schwere dilatative Kardiomyopathie die letztendlich zu einer Herzinsuffizienz führt. Schlussfolgend wurde die miRNA-142-5p als neuer Modulator des Calcineurin-NFAT Signalweges identifiziert.

The aim of this study was thus to systematically identify new miRNA modulators of the calcineurin-NFAT signaling pathway. First, an experimental setup for a high-throughput miRNA-screen was designed and tested. The screen was performed in a murine myoblast cell line carrying a luciferase expression cassette under the transcriptional control of four NFAT enhancer sites. During the subsequent analyses of the screen the influence of 1050 miRNA Mimics and 624 miRNA LNA™ inhibitors on the calcineurin-NFAT signaling pathway was tested. Ten miRNA Mimics were selected which showed a significant influence on calcineurin-NFAT signaling. The influence of these ten miRNA modulators on the NFAT activity was further studied in the primary culture of neonatal rat ventricular cardiomyocytes. Both cell systems show a consistent upregulation of NFAT activity by miRNA-142-5p. Therefore miRNA-142-5p was selected for further in vitro and in vivo characterization. Subsequent experiments showed that miRNA-142-5p attenuated the phenylephrine-induced hypertrophic effects in cultured cardiomyocytes. The negative regulation of hypertrophy by miRNA-142-5p is in contrast to the positive modulation in the calcineurin-NFAT pathway, which might be explained by an influence on the MAP kinase activity and the alternative miRNA-142-5p target gene p300. MiRNA-142-5p has been shown to play an important role in the transcriptional response of mouse models of cardiac disease such as transversal aortic constriction (TAC) and LAD ligation (myocardial infarct). To analyze the influence of the miRNA-142-5p on cardiac hypertrophy in vivo, a transgenic mouse line was now generated that overexpresses miRNA-142-5p in a heart-specific fashion. This transgenic mouse lines miRNA-142 show severe dilated cardiomyopathy, which finally leads to heart failure and early sudden death. In summary miRNA-142-5p was identified as a new modulator of the calcineurin-NFAT signaling pathway.