Characterisation of the Lysosomal Integral Membrane Protein Type-2 (LIMP-2) and its interaction with b-Glucocerebrosidase: implications for Parkinson and Gaucher Disease
The acid β-gluco¬cerebrosidase (GC) is a lysosomal hydrolase for β-glucose-terminated sphingolipids and reaches the lysosome through binding to its transport receptor the Lysosomal Integral Membrane Protein Type-2 (LIMP-2) in a mannose-6-phosphate independent manner. Mutations in GC cause the most common lyso¬somal storage disorder, Gaucher disease and represent the highest genetic risk factor for the development of Parkinson disease caused by accumulation of α synuclein. In this work properties of LIMP-2 and GC protein structure as well as their binding characteristics were analysed. By mutation and interaction studies, the GC-binding site on the LIMP 2 protein could be narrowed down to an exposed helical bundle comprised of two prominent helices. Surprisingly, a short peptide consisting of the proposed binding region of LIMP-2 was sufficient to mediate interaction with GC. Furthermore the LIMP-2-derived peptide had an activating effect on enzyme activity in vitro as well as in cell-based studies. The respective interaction site of LIMP-2 on the GC protein could also be narrowed down to a hydrophobic patch, verified by mutagenesis, interaction studies as well as peptide pulldown assays. Furthermore, effects of LIMP-2 deficiency in mouse brain were described exhibiting reduced levels of GC protein and activity, leading to aggregation of its substrates. Dysfunction of GC has been shown to interfere with α-synuclein homeostasis and its lysosomal degradation. In brain of LIMP-2-deficient mice α-synuclein accumulation could be observed, which led to severe neurological defects. Additionally, in cell-based experiments a distinct relationship between LIMP-2 expression, GC-activity and lysosomal degradation of α-synuclein was described. Heterologous expression of LIMP-2 in human and murine cell systems resulted in an increased lysosomal trafficking and activity of GC leading to a reduction of α-synuclein levels. This underscored the importance of the common function of LIMP-2 and GC in the intracellular regulation of α synuclein...
Die β-Glukozerebrosidase (GC) ist eine lysosomale Hydrolase, die β-Glukose-ständige Sphingolipide umsetzt. Durch die Bindung an den Transportrezeptor, dem lysosomalen integralen Membranprotein Typ-2 (LIMP-2) gelangt das Enzym vom Endoplasmatischen Retikulum Mannose-6 Phosphat unabhängig an seinen Wirkort –den Lysosomen. Mutationen in der GC führen zu der häufigsten lysosomalen Speichererkrankung, der Gaucher Erkrankung. Außerdem wurde beschrieben, dass Mutationen im Gen der β-Glukozere¬bro¬si-dase zu den häufigsten genetischen Risikofaktoren der Parkinson Krankheit zählen. Diese neurodegenerative Erkrankung ist durch die Akkumulation des neuronalen Proteins α-Synuklein charakterisiert. In dieser Arbeit wurden die strukturellen Eigenschaften des LIMP-2 Proteins sowie der GC untersucht. Dabei war der Fokus auf die strukturelle Untersuchung ihrer Interaktion gerichtet. Durch Mutations- und Interaktionsstudien konnte die GC-Interaktionsstelle im LIMP-2 Protein auf eine exponierte helikale Region eingeschränkt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein Peptid, bestehend aus der potentiellen Binderegion von LIMP-2, ausreichend ist um mit GC zu interagieren und sogar einen positiven Effekt auf die enzymatische Funktion aufweist. Eine erhöhte Enzymaktivität nach Peptid-Zugabe konnte sowohl in vitro, als auch in zellkulturbasierten Experimenten bestätigt werden. Zusätzlich konnte die entsprechende LIMP-2 Bindedomäne auf dem GC Protein identifiziert und ebenfalls auf einen hydrophoben helikalen Bereich im Enzym eingeschränkt werden...
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