Construction and use od cDNA arrays in studying barley seed development and foxtail millet salt tolerance

Abstract

Ein cDNA-Makroarray-Filter mit 1.421 Gersten-spezifischen Fragmenten wurde verwendet, um Netzwerke der Genexpression in maternalen und filialen Geweben während der Entwicklung des Gerstenkorns (0 - 12 Tage nach der Blüte, Days After Flowering = DAF) zu analysieren. Die Mehrzahl der in den maternalen Geweben während der frühen Entwicklung hochregulierten Gene codiert für verschiedene unbekannte Produkte, aber auch für Proteine mit Funktionen in Energie-Produktion und Kohlehydrat-Stoffwechsel. Während der späteren Entwicklung werden Mobilisierungsprozesse möglicherweise hormonell induziert, was aus der Expression von Mobilisierungs-Genen für Lipide und von Protease-Genen geschlußfolgert werden kann. In den filialen Geweben konnten Expressionsprofile identifiziert werden, die Spezifität für verschiedene Entwicklungsstadien besitzen. 25% der Gene, die während der Vorspeicherphase eine hohe Expression zeigen, haben Beziehung zu Zellteilungs- und -streckungsprozessen. Charakteristisch für die intermediäre Phase ist eine hohe Expression von Fotosynthese-assoziierten Genen. Während der beginnenden Speicherphase werden Gene der Stärkebiosynthese bevorzugt exprimiert, weiterhin Protease- und Trypsin/α-Amylase-Inhibitoren. Eine detaillierte Analyse der Glycolyse-spezifischen Genexpressionsmuster führte zu neuen Erkenntnissen über regulatorische Netzwerke während der Entwicklung der filialen Fraktion des Korns (besteht zum größten Teil aus Endosperm). Seg8, eine maternal beeinflußte Gersten-Mutante mit Defekten während der Samenentwicklung, wurde verwendet, um den Einfluß der maternalen Gewebe auf die Endosperm-Entwicklung zu untersuchen. Die Abweichung in der Endospermentwicklung ist bereits 4 DAF nachweisbar und prägt sich in der weiteren Entwicklung deutlich aus. Charakteristisch ist die Ausbildung von zwei Endosperm-Flügeln und das völlige Fehlen von Endosperm-Zellen in dem der nuzellaren Projektion gegenüberliegenden dorsalen Teil des Mutantenkorns. Das 1.421 Unigene enthaltende cDNA-Filter wurde verwendet, um Genexpressionsmuster der Mutante und des entsprechenden Wildtyps "Bowman" während der Samenentwicklung (0 - 14 DAF) zu vergleichen. Die vergleichende Expressionsanalyse zeigt, dass die Schlüsselgene des Kohlehydrat-Stoffwechses in den filialen Geweben der Mutante in geringerem Ausmaß exprimiert werden. Die beobachteten Veränderungen führen zu einer Verminderung der Stärkeakkumulation im seg8-Endosperm. Unter Verwendung eines cDNA-Makroarrays, der Stress-relevante Gerstengene enthielt, wurde unter Salzstress in Salz-toleranten 5 Tage alten Keimlingen der Fuchsschwanz-Hirse (cv. Prasad) die Hochregulation von Hydrogenperoxid-abbauenden Genen nachgewiesen, so z.B. von Phospholipid-Glutathionperoxidase (PHGPX), Ascorbat-Peroxidase (APX) und Catalase 1 (CAT1). In der sensitiven Varietät (cv. Lepakshi) wurde keine Hochregulation gefunden. Um den Salztoleranz-Mechanismus der toleranten Varietät auf der molekularen Ebene zu verstehen, wurde eine cDNA mit 85% bzw. 95% Homologie auf der DNA- bzw. Protein-Ebene zu einer PHGPX-Genfamilie von Gerste, die eine nicht-Selen-Glutathionperoxidase codiert, kloniert und charakterisiert. Durch Southernblot-Analyse wurde nachgewiesen, dass auch in der Fuchsschwanz-Hirse eine kleine Genfamilie existiert. Der Anstieg in der Menge des PHGPX-Proteins korreliert mit einer Zunahme der mRNA-Menge, wie durch Expressionsanalyse nachgewiesen werden konnte. Die deutliche Induktion der Expression des PHGPX-Gens läßt vermuten, dass das entsprechende Genprodukt eine Rolle in der Abwehr von Salz-induzierten oxidativen Abbauprozessen spielt.

EST-based macroarrays containing 1,412 inserts amplified from barley seed-specific cDNA clones were employed to study gene expression networks during development (0- 12 Days After Flowering, DAF) of the maternal and filial seed tissues. Most of the genes up-regulated during early development of the maternal tissues encode a lot of unknown products as well as proteins involved in energy production and carbohydrate metabolism. During later stages, mobilization processes were initiated possibly by hormonal induced pathwys as registered by the expression of lipid mobilization and proteases genes. For the filial tissues, developmental stage-specific transcript profiles were identified. During pre-storage phase, 25% of up-regulated genes are related to cell division and cell elongation processes. During the intermediate phase, mainly photosynthesis-associated genes are up-regulated. During the onset of storage phase, the filial fraction represents genes mainly belonging to specific metabolic pathways, for instance the starch- and storage protein biosynthetic pathways including several protease and amylase/trypsin inhibitor genes. A detailed examination of gene expression patterns related to sucrose-to-starch- and sucrose-to-pyruvate metabolism pathways provides new insights into gene networking during development of the filial fraction (mostly endosperm). Seg8, a maternal-affected barley mutant defective in seed development, provides an unique opportunity to study the influence of the maternal tissue on endosperm development. The failure of proper endosperm development in seg8, evident already 4 DAF becomes a prominent event with two lobes of endosperm and professed nucellar projection touching the dorsal crease during later development. In the present study, we used the 1,412-unigene cDNA array to compare gene expression during development (0-14 days after flowering, DAF) between mutant seg8 and its corresponding wild type 'Bowman'. Comparative expression analysis showed that key genes of the sugar-to-starch pathway are down regulated in the seg8 filial tissues. The observed changes in the expression of starch biosynthetis-pathway genes result in drastic reduction of starch accumulation in the seg8 endosperm. Using a cDNA macroarray containing a number of stress-related genes selected from barley cDNA libraries, hydrogen peroxide scavenging transcripts such as phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPX), ascorbate peroxidase (APX) and catalase 1 (CAT1) were found to be up regulated during salinity treatment of five-day-old salt-tolerant foxtail millet seedlings (cv. Prasad). No up-regulation was found in the sensitve variety (cv. Lepakshi). In order to understand the protection mechanism induced in the salt-treated tolerant seedlings at the molecular level, we cloned and characterized a foxtail millet cDNA encoding a PHGPX homologue, which shows 85% and 95% homology (DNA and protein level, respectively) to a stress-induced member of the small barley PHGPX gene family encoding a non-selenium glutathione peroxidases. As shown by Southern blot analysis, a small family of PHGPX genes exists in foxtail millet, too. The increase of the PHGPX protein level under salt stress parallels the higher PHGPX mRNA level found in the comparative expression analysis. The expression of the PHGPX gene, markedly induced in tolerant seedlings by high salt concentrations suggests that its product plays a role in defence against salt-induced oxidative damage.