Nachweis von Carbapenemase-bildender Erreger und deren Produkte

Die schnelle Verbreitung Carbapenem-resistenter Organismen sind weltweit ist ein großes Problem. Schnelle Nachweistests auf molekularbiologischer Ebene können als präventive Maßnahme eingesetzt werden, um eine Verbreitung einzudämmen und Verbreitungswege sowie deren Ursachen nachzuvollziehen. Zudem können sie helfen, die Wahl von Therapie-Ansätzen zu erleichtern. In dieser Arbeit sollte eine Machbarkeitsstudie durchgeführt werden, bei dem ein Multiparameter-Testsystem entwickeln und evaluiert werden sollte. Dabei sollten die vier wichtigsten Carbapenemase-Gene (blaKPC, blaNDM, blaVIM und blaOXA-48) aus einer nativen Probe isoliert, gefangen, amplifiziert und detektiert werden können. Als Plattform wurde der m-PIMA-Analyzer (ABBOTT) ausgewählt. Dabei wurde die handelsübliche m-PIMA-Kartusche so umgestaltet, dass sie für die Prozessierung von Stuhlproben geeignet ist. Für das Fangen der DNA wurde dafür ein pH-abhängiger Bindungsmechanismus implementiert, bei dem DNA unspezifisch über Protonierung der Fänger-Beads gefangen werden. Es wurde ein Mikroarray mit spezifischen DNA-Sonden designt, welcher für die Detektion der Zielgene genutzt wurde. Die Detektion erfolgte über das CMA-System (engl. competitive reporter monitored amplification). Für die Optimierung der PCR-Reaktion wurden zwei quantitative realtime-PCR (rt-qPCR) Modellsysteme etabliert, die Spezies-rt-qPCR und die Carbapenemase-rt-qPCR. Hierfür wurden die Nachweisgrenzen sowie die Spezifität und Sensitivität ermittelt. Weiterhin wurde die Probenvorbereitung (Lyse, Fangprozess etc.) sowie auch die PCR (Primer- und Reporterkonzentration, PCR-Programm etc.) weiter optimiert zur Verbesserung der Sensitivität und Reduzierung der Prozessierungszeit. Schlussendlich wurden alle Komponenten in der Prototyp-Kartusche vereint und in Form einer Evaluierungsstudie mit gespikten Stuhlproben getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die 4 Carbapenemase-Gene erfolgreich in Stuhlproben nachgewiesen werden konnten.

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