Grenzen der Messbarkeit bei der Analyse des Schaltens von HCN2-Kanälen

HCN-Kanäle sind Kationenkanäle und in zahlreiche rhythmisch ablaufende physiologische Prozesse involviert. Über ihren tetrameren Aufbau und die langsame Aktivierung durch Hyperpolarisation sowie die Modulation durch cAMP ist bereits viel bekannt, während die Kinetik des spannungsabhängigen Schaltens, dem sog. Gating-Prozess, bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden konnte. Grundsätzlich sollte die Bewegung der positiv geladenen S4-Helix wie bei strukturell verwandten Nav- und Kv-Kanälen auch beim HCN-Kanal als Gating-Strom gemessen werden können. Zur Messung von Gating-Strömen mithilfe der Cut-Open-Voltage-Clamp-Technik wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst u. a. der Einsatz von Cs als HCN-spezifischer Blocker und der Austausch der permeablen Kationen durch NMDG untersucht, um den Ionenstrom vollständig zu eliminieren. Beide Verfahren konnten den Ionenstrom allerdings nicht komplett eliminieren, sodass Gating-Ströme auf diese Weise nicht gemessen werden konnten. Daraufhin wurde versucht, den Ionenstrom durch Messungen mit Spannungen nahe des Umkehrpotentials zu verringern, wobei Ströme gemessen wurden, die möglicherweise auf Off-Gating-Ströme zurückzuführen sind. Da jedoch mit dieser Methode die Messung von On-Gating-Strömen nicht möglich war, wurde versucht, nicht-leitende Porenmutanten des HCN2-Kanals zu konstruieren. Dabei wurde zwar festgestellt, dass alle untersuchten Porenmutanten weiterhin Ionenströme zeigten, allerdings war insbesondere bei den beiden Mutanten mHCN2-G402S und -G404S ein charakteristisches Verhalten aus Aktivierung, Inaktivierung und zusätzlicher langsamer Aktivierung zu beobachten, das zum besseren Verständnis des HCN2-Kanals tiefergehend analysiert wurde. Dabei wurde gezeigt, dass die Ströme aus zwei unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Leitfähigkeiten stammen. Die ersten Komponenten können dabei auf die mutierten HCN-Kanäle, die späte Aktivierung auf unsystematisch auftretende endogene Chlorid-Kanäle zurückgeführt werden.