Auswirkungen ausgewählter REEP1-Mutationen auf das Spleißen von prä-mRNA

Das REEP1-Gen liegt auf Chromosom 2 (2p11.2) und kodiert für ein integrales Membranprotein mit Lokalisation im endoplasmatischen Retikulum. REEP1-Mutationen stehen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. Schon länger sind sie als krankheitsverursachend für HSP Typ 31 bekannt. Im Jahr 2012 wurde allerdings gezeigt, dass sie auch mit dHMN V einhergehen können. In einer Familie mit dHMN V konnte eine Mutation im Spleißakzeptor von Intron 4 des REEP1-Gens nachgewiesen werden, die zu einer kompletten Deletion des Exons 5 ohne Verschiebung des Leserasters führt. Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung weiterer Mutationen im Exon 5 oder den dazugehörigen Spleißstellen der benachbarten Introns 4 und 5, die mit Veränderungen im prä-mRNA-Spleißen und damit einem Verlust des Exons 5 einhergehen könnten. Da einige Patienten mit HSP auch phänotypische Merkmale der dHMN V (v.a. eine Atrophie der Handmuskulatur) zeigen, sollten außerdem mögliche Zusammenhänge von prä-mRNA-Spleißen und Phänotyp untersucht werden. Zusätzlich erfolgte die in-silico-Analyse aller Varianten hinsichtlich potentieller Spleißstellen und exonischer Spleißverstärker. Die experimentellen Untersuchungen wurden mithilfe eines Minigen-Systems durchgeführt, da REEP1 nicht im peripheren Blut exprimiert wird. Zu den wichtigsten Arbeitsschritten gehörten die zielgerichtete Mutagenese und die Klonierung der daraus resultierenden DNA-Fragmente zunächst in den TOPO- und schließlich in den pSPL3-Vektor. Nach erfolgreicher Klonierung erfolgte die Transfektion von HeLa-Zellen, die in der Lage sind prä-mRNA zu Spleißen. Die mRNA wurde isoliert, in cDNA umgeschrieben und diese mittels PCR amplifiziert. Da es bei den mit REEP1 assoziierten Erkrankungen noch viele offene Fragen gibt, soll mit den Ergebnissen dieser Dissertation ein Beitrag zum besseren Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen geleistet bzw. das Wissen bezüglich des Spektrums dieser Erkrankungen erweitert werden.