Role of individual subunits in Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-modulated (HCN) channel gating
Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-modulated (HCN) channels are tetramers that elicit electrical rhythmicity in special brain neurons and cardiomyocytes. These channels are non-selective cationic channels which are activated by hyperpolarizing voltages and modulated by the binding of adenosine 3, 5 -cyclic monophosphate (cAMP) to the four cyclic nucleotidebinding domains (CNBD). The binding of cAMP shifts steady-state activation to more positive voltages, thereby accelerating the activation and increasing the current along with a slowing effect on deactivation. Inspite of knowing the structure of the isolated CNBDs by crystals and X-ray analysis and very recent insights into the HCN1 structure by cryo-electron microscopy, many questions on the function of these channels remain open. In particular, how the successive binding of four cyclic nucleotides is transmitted to change the operation of the channels and how the two stimuli,hyperpolarization and cAMP binding, are interlinked. So, the aim of this work was to study the role of individual subunits in the ligand (cAMP)-dependent activation and deactivation process of HCN2 channels with the help of patch-clamp technique and Xenopus laevis oocytes as an expression system. This project was focused to analyze the effects of cAMP binding to the subunits of HCN2 concatameric channels with a defined number of functional CNBDs. It was found that each liganded CNBD promotes channel activation in an additive manner irrespective of their position within the tetramer. In contrast, the open probability reached its maximum already when only two subunits were liganded. However, the process of deactivation was differently influenced by cAMP binding. Liganding of four, three, or at least two CNBDs in trans position slowed the deactivation process, whereas channels with either two functional CNBDs in cis position or with a single functional subunit were ineffective to decelerate the deactivation process. Together the results showed herein support an activation mechanism in which each single liganded CNBD (out of four) supports channel opening by causing a turning momentum on the tetrameric intracellular gating ring, thereby stabilizing the open pore. For maintaining activation, however, at least two subunits in trans position are needed to be liganded.
Durch Hyperpolarisation aktivierte und zyklische Nukleotide modulierte (HCN-) Kanäle sind Tetramere, die die elektrische Rhythmizität in spezialisierten Neuronen und Herzzellen vermitteln. Sie sind nicht-selektive Kationenkanäle, die durch Hyperpolarisation geöffnet und durch die Bindung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) an vier intrazelluläre Bindungsstellen (CNBDs) moduliert werden. Die Bindung von cAMP führt zu einer Verschiebung der Gleichgewichts-Aktivierung zu positiveren Spannungen, zu einer Beschleunigung der Aktivierung, zu einer Zunahme der Stromamplitude bei sättigender Hyperpolarisation sowie zu einer Verlangsamung der Deaktivierung. Trotz der Aufklärung der Struktur isolierter Bindungsstellen, sowie eines gesamten HCN-Kanals durch Röntgenstrukturanalyse bzw. Cryo-Elektronenmikroskopie, bleiben viele Fragen bezüglich des Kanalverhaltens offen. Dazu gehört die Frage, wie die Bindung der zyklischen Nukleotide in eine Konformationsänderung der Pore übersetzt wird und wie die beiden Stimuli Spannung und cAMP zusammenwirken. Ziel dieser Studie war es daher, die Rolle der individuellen Untereinheiten in der ligandenabhängigen Kanalaktivierung und –deaktivierung mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik unter Verwendung von Xenopus laevis-Oozyten als heterologem Expressionssystem zu untersuchen. Dabei lag der Fokus auf der Analyse des cAMP-abhängigen Schaltens in konkatenierten HCN2-Kanälen mit einer definierten Anzahl funktioneller Bindungsstellen. Es konnte gezeigt werden, dass jede ligandierte Bindungsstelle die Kanalaktivierung fördert und in einer additiven Weise zur cAMP-abhängigen Verschiebung der halbmaximalen Spannung beiträgt. Dabei spielt die Position innerhalb des Tetramers keine Rolle. Die maximale Offenwahrscheinlichkeit dagegen wurde bereits durch die Ligandierung von nur zwei Bindungsstellen erreicht. Auch in diesem Fall war die Position der zwei besetzten Bindungsstellen im Tetramer nicht relevant. Im Fall der Deaktivierung ist dagegen die Position der Besetzung wichtig: Nur die Ligandierung von vier, drei oder zwei Bindungsstellen in trans-Position konnte die Deaktivierung verlangsamen. Die Besetzung von zwei Bindungsstellen in cis-Position bzw. von nur einer Bindungsstelle blieb wirkungslos. Zusammenfassend unterstützen die vorliegenden Ergebnisse einen Aktivierungsmechanismus, in dem jede einzelne ligandierte Bindungsstelle die Öffnung des Kanals begünstigt, indem eine Drehbewegung im intrazellulären Gatingringbewirkt wird, die den offenen Zustand des Kanals stabilisiert. Die Beibehaltung dieses offenen Zustandes erfordert mindestens zwei ligandierte Bindungsstellen in trans-Position.
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