GABA mediates synaptic inhibition in the adult brain. However, in early development elevated intracellular Cl concentration ([Cl]in) by NKCC1 causes GABAA receptor (GABAAR) activation to be depolarizing in immature cortical neurons. Despite the potential promotion effect of depolarizing GABA for neuronal network development, a coherent picture cannot be drawn due to a lack of appropriate tools to manipulate the [Cl]in in the central nervous system (CNS). An Emx1-dependent conditional NKCC1 knockout mouse line which harbors disrupted NKCC1 function in cortical pyramidal cells and glia cells but leaving interneurons unaffected was used to explore the role of depolarizing GABAergic transmission on cortical network development. Optimized photo-stimulation of the optogenetic Cl pump eNpHR3.0 enables stable photo-currents, hence Cl loading, on longer time-scales. Next, combined with the optogenetic tool and patch-clamp techniques, the present work shows that NKCC1 contributes to GABAergic depolarization, and eNpHR3.0-mediated artificial loading of Cl in Emx1 positive cells contributes to the generation of spontaneous correlated network activity in the hippocampus in vitro. Disruption of NKCC1 function in Emx1 positive cells impairs such activity. However, this impairment is not due to an altered intrinsic excitability. In addition, the synaptic maturation is not affected in both GABAergic and glutamatergic synaptic transmission. The GABAAR-mediated mGPSCs in cells from NKCC1 KOEmx1 animals undergo a normal developmental increase in frequency and acceleration in decay kinetics, while the AMPAR-mediated mEPSCs undergo a developmental increase in frequency and slowdown in decay kinetics. Three-dimensional voxel-based two-photon imaging revealed column-like Ca2+ clusters in visual cortex representing early spontaneous network activity. With the use of in vivo wide-field imaging technique, the present work shows that the deletion of NKCC1 in Emx1 positive cells does not affect the development of spontaneous network activity in the visual cortex, as the Ca2+ cluster frequency and cluster size undergo a developmental increase and they do not significantly differ between WT and NKCC1 KOEmx1 animals. In conclusion, NKCC1-mediated depolarizing action of GABA is not required for major aspects of cortical network development although it contributes to the generation of spontaneous network activity in the hippocampus in vitro.
GABA vermittelt synaptische Hemmung von Neuronen im adulten Gehirn. In der frühen Entwicklung bewirkt eine erhöhte intrazelluläre Cl– Konzentration ([Cl–]in) durch NKCC1, dass die Aktivierung des GABAA Rezeptors (GABAAR) in unreifen kortikalen Neuronen depolarisierend wirkt. Obwohl der depolarisierende Effekt von GABA möglicherweise zur Reifung neuronaler Netzwerke beiträgt, ergibt sich aktuell kein kohärentes Bild. Hierfür fehlten bislang geeignete Instrumente zur Manipulation von [Cl–]in im zentralen Nervensystem (ZNS). Eine Mauslinie mit einem konditionalen Knockout von NKCC1 unter der Kontrolle des Emx1 Promoters, die eine gestörte NKCC1 Funktion in kortikalen Pyramidenzellen und Gliazellen zur Folge hat, aber Interneurone unberührt lässt, wurde verwendet, um die Rolle der depolarisierenden GABAergen Übertragung für die Entwicklung des kortikalen Netzwerks zu untersuchen. Eine optimierte Photostimulation der optogenetischen Cl– Pumpe eNpHR3.0 ermöglicht stabile Photoströme und damit Cl– Beladung auf längeren Zeitskalen. Des Weiteren wird in der vorliegende Arbeit mithilfe optogenetischer Methoden und Patch-Clamp-Techniken nachgewiesen, dass NKCC1 zur GABAergen Depolarisation beiträgt und eine künstliche Beladung von Cl– durch eNpHR3.0 in Emx1 positiven Zellen das Auftreten spontaner korrelierter Netzwerkaktivität im Hippocampus begünstigt. Die genetische Deletion von NKCC1 in Emx1 positiven Zellen beeinträchtigt diese Aktivität. Die Beeinträchtigung kann jedoch nicht auf eine veränderte intrinsische Erregbarkeit zurückgeführt werden. Darüber hinaus ist die synaptische Reifung sowohl für GABAerge als auch für glutamaterge Übertragung nicht betroffen. Die GABAAR vermittelten mGPSCs in Zellen von NKCC1 KOEmx1 Tieren durchlaufen einen normalen Entwicklungsanstieg der Frequenz und eine Beschleunigung der Abklingkinetik, während die AMPAR vermittelten mEPSCs einen Entwicklungsanstieg der Frequenz und eine Verlangsamung der Abklingkinetik erfahren. Die dreidimensionale voxel-basierte Zwei-Photonen-Bildgebung zeigte säulenartige Ca2+ Cluster, welche die frühe spontane Netzwerkaktivität im visuellen Kortex repräsentieren. Mittels In-vivo-Weitfeld-Bildgebung konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Deletion von NKCC1 in Emx1-positiven Zellen die Entwicklung spontaner Netzwerkaktivität im visuellen Kortex nicht beeinflusst, da die Ca2+ Clusterfrequenz und Clustergröße einen Entwicklungsanstieg erfahren und sich nicht zwischen WT und NKCC1 KOEmx1 Tieren signifikant unterscheiden. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die NKCC1-vermittelte depolarisierende Wirkung von GABA für wesentliche Aspekte der kortikalen Netzwerkentwicklung nicht erforderlich ist, obwohl sie in vitro zur Erzeugung der spontanen Netzwerkaktivität im Hippocampus beiträgt.
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