Analyse von Aminosäuresubstitutionen im Thymidinkinase-Gen von Herpes-simplex-Viren hinsichtlich ihrer Bedeutung für eine Resistenz gegenüber Virostatika

Goldstandard in der Therapie von Infektionen mit dem Herpes-simplex-Virus (HSV) ist Acic-lovir (ACV). Resistenzen treten vor allem bei immunsupprimierten Patienten auf, welche häu-fig von schwerwiegenden Infektionen betroffen sind. Zur Abklärung einer Resistenz hat sich die Untersuchung des viralen Phänotyps als zuverlässig, jedoch sehr zeitaufwändig erwiesen. Deshalb werden vermehrt schnelle genotypische Analysen angewendet. Hierbei werden die Thymidinkinase (TK)- und DNA-Polymerase-Gene sequenziert und mit einem ACV-sensitiven Referenzstamm verglichen. Problematisch ist jedoch das Auftreten unbekannter Aminosäure (AS)-Substitutionen, sodass keine Aussage über das Resistenzverhalten getroffen werden kann. Deshalb sollten in dieser Arbeit 20 bezüglich ihrer Resistenzassoziation unklare AS-Substitu-tionen aus klinischen Stämmen des Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) charakterisiert wer-den. Hierfür wurden rekombinante TK-Proteine synthetisiert, deren Phosphorylierungsaktivität anschließend mittels modifiziertem DiviTumTM-Assay mit Bromdesoxyuridin als TK-Substrat evaluiert wurde. Zusätzlich sollten zwei Methoden implementiert werden, die ACV sowie Des-oxythymidin (dT) als Substrat für die rekombinanten Proteine verwendeten. Dies war mittels Flüssigchromatographie/Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) nur einge-schränkt erfolgreich. Mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie/Ultraviolettspektroskopie (HPLC/UV) konnten im Gegensatz dazu nicht nur der Gehalt an ACV und ACV-Phosphat bzw. dT und dT-Phosphat, sondern auch die Konzentration von ATP und ADP bestimmt werden. Diese Methode erlaubte somit die Unterscheidung zwischen Mutanten ohne Phosphorylie-rungsaktivität sowie mit reduzierter Aktivität oder veränderter Substratspezifität. Die erzielten Ergebnisse liefern damit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Genpolymorphismus der HSV-1-TK und können die Resistenz-adaptierte antivirale Therapie von HSV-Infektionen wei-ter verbessern.