Structured Illumination Microscopy (SIM) is a super-resolution microscopy method which enables a two-fold resolution enhancement with respect to classical wide-field (WF) fluorescence microscopy. In SIM, the sample is illuminated by a pattern, typically a sinusoidal grid of light. This pattern is typically the result of interference of either two or three plane waves. The wide dissemination of SIM is limited by the difficulties arising during the necessary numerical reconstruction. Artefacts are observed in the SIM reconstructed images if the illumination pattern is distorted or unknown. Blind-SIM is a deconvolution-based reconstruction approach that enables to reconstruct both the sample and the illumination pattern. Blind-SIM is able to reconstruct partially or fully unknown illumination patterns and is therefore robust to distortions. However, so far blind-SIM was not able to process data from thick samples where the visibility of the fringes is reduced by the presence of out-of-focus light. In this work, we present the thick slice blind-SIM algorithm which reconstructs a 3D stack from a 2D measurement, thus removing the out-of-focus light. The acquisition speed in 3D SIM is limited by the axial scanning and sequential focusing. Using a multifocus detection enables to simultaneously acquire a focal series. Merging SIM excitation with multifocus detection (MF-SIM) permits to enhance the volumetric acquisition speed of 3D SIM as well as removing the need for axial mechanical scanning, a source of sample drift and vibrations. The recorded MF-SIM data does not obey the same theoretical description as the conventional scanning 3D SIM data. Hence, the classical approach for 3D SIM reconstruction cannot be applied. We developed a deconvolution-based algorithm using known 3D illumination pattern that can be applied to the reconstruction of MF-SIM data. The results demonstrate enhanced resolution in all three dimensions.
Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) zählt zu den hochauflösenden Mikroskopieverfahren und erreicht die doppelte Auflösung im Vergleich zur normalen Weitfeldmikroskopie. Bei SIM wird die Probe mit einem Muster – typischerweise einem Lichtgitter - beleuchtet. Dieses Muster entsteht durch die Interferenz zweier oder dreier ebener Wellen. Die nötige Datenverarbeitung der rohen SIM-Bilder führt zu Artefakten wenn das Beleuchtungsmuster unbekannt oder verzerrt ist. Blind-SIM ist ein Entfaltungsbasierter Ansatz, der sowohl die Rekonstruktion der Probe als auch die des Beleuchtungsmusters ermöglicht. Blind-SIM ist fähig, Daten mit völlig oder teilweise unbekanntem Beleuchtungsmuster zu bearbeiten und ist deswegen robust gegenüber Verzerrungen dieser Muster. Thick slice blind-SIM hingegen erzeugt einen 3D Stapel aus einer 2D-Aufnahme. Dadurch ist es in der Lage, Beiträge von Licht außerhalb der Fokusebene zu entfernen. Durch das Zweistrahl-SIM Verfahren lassen sich entweder optisch Probenschnitte erzeugen oder eine Maximierung der lateralen Auflösung erzielen. Eine Kombination mit thick slice blind-SIM ermöglicht beides gleichzeitig. Thick slice blind-SIM zeigt durch die Bearbeitung einer einzelnen ausgewählten Ebene eine vergleichbare Verbesserung des Auflösungsvermögens und der optische Sectioning Fähigkeit wie die 3D Bearbeitung eines 3D aufgenommenen SIM Stapels. Die Aufnahmegeschwindigkeit für 3D SIM ist durch axiales mechanisches Abtasten in Verbindung mit Nachfokussierung begrenzt, wohingegen eine multifokus Detektion die gleichzeitige Aufnahme einer fokalen Serie ermöglicht. Die Kombination von SIM-Anregung und multifokus Detektion (MF-SIM) ermöglicht es, die Aufnahmegeschwindigkeit von 3D SIM zu verbessern. Das MF-SIM Verfahren macht neue Ansätze der Rekonstruktion nötig, wofür sich ein entfaltungsbasierter Algorithmus, welcher auf bekannten 3D-Beleuchtungsmustern beruht, eignet.
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