Molekulare Analysen des Aktinzytoskeletts und des polaren Wachstums in Ashbya gossypii und Candida Albicans

Pilze wachsen entweder in einer zelligen Form wie z.B. die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae oder in filamentöser Form wie z.B. Aspergillus nidulans oder Ashbya gossypii. Einige humanpathogene Pilze wie Cryptococcus neoformans und Candida albicans sind dimorphe Pilzen, die einen Wechsel von der Hefe- in die Hyphenphase vollziehen können. Ziel dieser Arbeit war die vergleichende molekulare Untersuchung solcher Wachstumsprozesse sowohl in A. gossypii als auch in C. albicans, um ein besseres Verständnis über die morphogenetischen Netzwerke, die polares Zellwachstum steuern, zu erzeugen. Zunächst wurden Module zur gerichteten Veränderung von Genen erzeugt, um die Funktionsanalyse von Genen in diesen Modellorganismen zu erleichtern. Mit diesen Modulen können durch PCR spezifische Kassetten erzeugt werden, die die exakte Deletion von offenen Leserastern ermöglichen. Ebenso gelingt damit die Expression von Genen durch regulierbare Promotoren wie auch die Fusion mit dem Gen, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert. Mit den entsprechenden Fusionsproteinen kann die subzelluläre Lokalisierung des Zielproteins bestimmt werden. Der zusammengesetzte Aufbau der Module erlaubt es in einfacher Weise, Markergene oder GFP-Varianten auszutauschen, um neue Module herzustellen. Die Module können mit einer minimalen Anzahl an Oligonukleotid-Primern amplifiziert werden, um das gesamte Spektrum der Kassetten zu erzeugen. Mit Verwendung der etablierten PCR-Technologie konnte eine große Zahl von Transformanten in C. albicans mit den gewünschten Veränderungen erzeugt werden, wenn die Länge der benutzen flankierenden Sequenzen 100bp betrug. Polares Zellwachstum, insbesondere in filamentösen Pilzen, erfordert eine stark polarisierte Organisation des Aktinzytoskeletts. Das Aktinzytoskelett wird durch GTPbindende Proteine der Rho-Familie reguliert. Rho-Proteine sind molekulare Schalter, die mit Hilfe von Guanin-Nukleotid Austauschfaktoren (GEFs) und GTPase-aktivierenden Proteinen (GAPs) zwischen aktivierten (GTP-gebundenen) und inaktiven (GDPgebundenen) Zuständen wechseln können. Aktivierte G-Proteine leiten Signale an Effektorproteine weiter, die wie im Fall des konservierten Cdc42-Proteins, die Aktinassemblierung regulieren und damit die Etablierung von Zellpolarität und deren Beibehaltung kontrollieren. Das A. gossypii Genom enthält mit RHOH eine zusätzliches Rho-Gen, das in S. cerevisiae nicht vorkommt. RHOH ist ein Paralog des A. gossypii RHO1 Gens und entstand durch lokale Genduplikation. RhoHp besitzt zumindest überlappende Funktionen mit Rho1p bei der Aufrechterhaltung von Zellpolarität. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Durchführung tiefer gehender Analysen zur Funktion der Wiskott-Aldrich-Syndrom Protein- (WASP)-Homologen in A. gossypii und C. albicans. In beiden Organismen spielen die entsprechenden Homologen WAL1-Gene eine Schlüsselrolle für die Beibehaltung der Zellpolarität und der Positionierung des kortikalen Aktins (der sog. Aktinpatches). In einer vorangegangenen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von WAL1 in C. albicans die Hyphenbildung inhibiert, während eine A. gossypii WASP Mutante langsames Wachstum und angeschwollene Hyphen aufweist. Durch die Verwendung der in vivo Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie konnte die Aufnahme des lipophilen Farbstoffes FM4-64 beobachtet werden. Dabei konnte die Verteilung und die Bewegung kleiner Endozytosevesikel und größerer Vakuolen durch hochauflösende Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Es zeigte sich, dass hochmobile Vesikel in den Hyphenspitzen des A. gossypii Wildtyps vorhanden waren, die in der A. gossypii .wal1 Mutante gänzlich fehlten. In der A. gossypii .wal1 Mutante erscheinen solche Vesikel in subapikalen Hyphenabschnitten. Dies zeigt, dass die Position der Aktinpatches, die sich ebenfalls in diesem subapikalen Bereich befinden, mit der Position von Endozytoseereignissen zusammenfällt. Dies spricht für eine Rolle von Wal1p bei der Positionierung der Aktinpatches in der Hyphenspitze. Die Bewegung von großen Vakuolen, die im Wildtyp leicht als zytoplasmatische Strömung sichtbar ist, war in A. gossypii .wal1 Hyphen sehr langsam und erschien unkoordiniert. Interessanter Weise wurden Mitochondrien im Gegensatz zu den Endosomen in den Hyphenspitzen der .wal1 Mutante ebenso wie im Wildtyp gefunden. Dies belegt, dass es unterschiedliche Transportmechanismen für beide Organellen geben muss. Ähnliche Ergebnisse bezüglich des Endozytosedefektes wurden auch für die C. albicans .wal1 Mutante erhalten. Die starke Verzögerung bei der Aufnahme des Farbstoffes wurde von Defekten in der Vakuolenmorphogenese begleitet, die in A. gossypii nicht beobachtet werden konnten. Statt einer einzigen großen Vakuole enthielten C. albicans .wal1 Zellen oftmals viele kleinere. Keine der hypheninduzierenden Bedingungen, die bei C. albicans wal1 Mutante getestet wurden, resultierte in einer Hyphen- bzw. Myzelbildung. Hyphenbildung bei C. albicans hängt von der Ras1-GTPase ab, die zwei Signalkaskaden, eine MAP-Kinase Kaskade und den cAMP-Weg, aktiviert. Integration eines konstitutiv aktiven RAS1-Allels in einen Wildtyp-Stamm resultiert in Hyphenwachstum auch unter nichtinduzierenden Bedingungen. Trotzdem war dieses konstitutiv aktive RAS1-Allel in der .wal1 Mutante nicht in der Lage, die Hyphenbildung anzuregen. In einem in vivo Mausmodell einer systemischen C. albicans Infektion zeigte der C. albicans wal1 Stamm verglichen mit Wildtypstämmen eine reduzierte Virulenz. Dieses Verhalten wurde mit einem in vitro Modell unter Verwendung von Schweinedarm-Epithel verglichen. Zellen des Wildtyps zeigten sehr starke Adhärenz an dieses Epithel und wurden zu einer intensiven Hyphenbildung angeregt. Im Gegensatz dazu zeigten .wal1 Zellen nur eine schwache Adhäsion und waren auch unter diesen Bedingungen nicht in der Lage, Hyphen zu bilden. Dies zeigt, dass zwei Faktoren, die die Virulenz von C. albicans beeinflussen können, von einer Deletion des WAL1 Gens beeinflusst werden. Die vorgelegte Arbeit belegt, dass WASP-Homologe eine entscheidende Rolle bei der Koordinierung von Endozytose und polarem Zellwachstum in zwei unterschiedlichen Pilzsystemen spielen. Dies zeigt, dass polares Wachstum nicht nur einen intakten sekretorischen Weg benötigt, sondern auch von der korrekten Positionierung des kortikalen Aktins an den Stellen der Endozytose in der Hyphenspitze abhängt. In C. albicans konnten selbst starke hypheninduzierende Stimuli den wal1 Defekt nicht supprimieren. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signalwege zum Aktinzytoskelett und die Aktinassemblierung essentiell an der Hyphenmorphogenese in C. albicans und A. gossypii beteiligt sind.