Development of an artificial silk protein on the basis of a lacewing egg stalk protein

Titelangaben

Bauer, Felix:
Development of an artificial silk protein on the basis of a lacewing egg stalk protein.
Bayreuth , 2014 . - I, 95 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Silks are widely used in textile industry as clothing and furnishings due to their tensile strength, smoothness, soft texture, lustre, and drape. Most commonly silk of the mulberry silkworm Bombyx mori (B. mori) is used in such applications, however, silks evolved independently in many different arthropods for various purposes.1 During evolution the different silks were optimised for their task-specific uses over millions of years, e.g. adopting different mechanical properties. The mechanical properties mainly derive from the protein secondary structure and its higher order arrangement in silk fibres. Spider silk, for example, is known for its tensile properties surpassing nylon, Kevlar®, silkworm silk, and high-tensile steel.2-5 Beyond their mechanical properties, some silks are also reported to be biocompatible and non-immunogenic.6 One beneficial feature of silk proteins is the possibility to process them into various morphologies.7, 8 Several of these silk features make them interesting for material scientists, intending to produce silks with tuneable properties depending on the desired application, ranging from technical ones such as high performance fibres to medical ones such as drug delivery. This thesis deals with the characterisation and reproduction of a less explored silk, the lacewing egg stalk silk. Mechanical testing revealed a strong dependence on the relative humidity. In the dry state at 30% relative humidity, the stalks are quite rigid and break at an elongation of 2% whereas at 70% and 100% relative humidity they elongate up to 434%. This extension is accompanied by a secondary structure change from cross-ß to parallel-ß. The cross-ß structure in unstretched stalks provides bending stiffness and rigidity to the stalk, and this bending stiffness gets lost when the stalks are stretched. In this thesis a model is proposed which explains these differences at various relative humidity on the molecular level, wherein changes in the strength of hydrogen bonds upon exposure to water (a hydrogen bond donor/acceptor) in combination with multiple disulphide cross-links (which are not affected by water) act together and are responsible for this behaviour. Based on consensus sequences of published sequence data (derived from MalXB2 an egg stalk protein of Mallada signata (M. signata)),9 an engineered egg stalk protein named N[AS]8C was recombinantly produced. To produce an artificial stalk, a droplet of a solution of purified N[AS]8C was placed on a substrate, and tweezers were used to pull out a fibre. After drying, and post treatment, the properties of the artificial stalks were investigated in comparison to the natural ones. Mechanical testing revealed similar behaviour at 30% relative humidity, but at 70% and 100% relative humidity the artificial stalks were not as extensible as the natural ones. This corresponds to the fact, that no cross-ß structure was formed, and, therefore, no rearrangement into parallel-ß structure was possible. Subsequently, N[AS]8C was processed into non-fibrous morphologies. It was possible to produce capsules, hydrogels, foams, and films. The foams show an interesting micro and nano structure which differs from that of recombinant spider silk. The cavities are filled with a mesh of nano fibres building a 3D scaffold. Films are a morphology with potential for application in cell culture. Fibroblast attachment on N[AS]8C films is quite poor. Therefore, we tried to induce guided fibroblast growth on patterned protein films. A first layer of the films was cast from ntagCysC16-c(RGDfK), an engineered spider silk protein coupled with the integrin recognition motif RGD to provide a protein layer to which fibroblasts attached well. The second protein layer was produced using a PDMS (polydimethylsiloxane) template and N[AS]8C. Fibroblasts grown on these films adhere only to the RGD modified spider silk and not to the N[AS]8C areas. A second feature of such films is to orient the fibroblasts on films with alternating lines of the two proteins. Such films might be useful for tissue engineering to control cell adhesion and get a structured cell pattern. This is essential for many tissues such as bones, muscles, and epithelia tissue. The low cell adhesion properties of N[AS]8C films might be interesting for coatings for applications where cell adhesion is not desired such as stents or catheters.

Abstract in weiterer Sprache

Seide ist wegen ihrer Reißfestigkeit, Glätte, weichen Textur, ihres Glanzes und ihres Faltenwurfs ein in der Textilindustrie weit verbreitetes Material für Kleidungsstücke und Einrichtungsgegenstände. Meist wird für solche Anwendungen die Seide des Maulbeerspinners Bombyx mori (B. mori) verwendet. Seiden entwickelten sich unabhängig in vielen Arthropoden und werden zu verschiedensten Zwecken verwendet.1 Für diese wurden sie seit Millionen von Jahren durch die Evolution optimiert. Zum Beispiel haben Seiden unterschiedliche mechanische Eigenschaften entwickelt, welche hauptsächlich von der Sekundärstruktur der Proteine und ihrer übergeordneten Anordnung in den Seidenfäden abhängen. Spinnenseide ist beispielsweise bekannt für ihre Zugdehnungseigenschaften, welche die von Nylon, Kevlar®, Seidenspinnerseide und hochfestem Stahl überragen.2-5 Darüber hinaus gelten viele Seiden als biokompatibel und nicht immunogen.6 Eine weitere nützliche Eigenschaft von Seidenproteinen ist deren Verarbeitbarkeit in viele verschiedene Morphologien.7, 8 Viele dieser Eigenschaften machen Seiden interessant für Materialforscher, welche Seide mit gezielt beeinflussbaren Eigenschaften, abhängig von der erwünschten Anwendung, produzieren wollen. Denkbare Anwendungen reichen von Hochleistungsfasern für technische Anwendungen bis zu medizinischen Anwendungen, wie gezielte Pharmakotherapie. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Charakterisierung und der rekombinanten Herstellung eines wenig erforschten Seidenproteins aus Florfliegen Eierstielen. Mechanische Tests an Florfliegen Eierstielen zeigten eine starke Abhängigkeit der Dehnbarkeit von der Luftfeuchtigkeit. Im trockenen Zustand bei 30% relativer Luftfeuchtigkeit sind die Stiele biegesteif und brechen bei einer Dehnung von 2%, wohingegen sie bei 70% und 100% relativer Luftfeuchtigkeit bis zu ca. 430% dehnbar sind. Diese Dehnung korreliert mit einer Sekundärstrukturänderung von cross-ß zu parallel-ß. Die cross-ß Struktur in ungestreckten Stielen wird für deren Biegesteifigkeit verantwortlich gemacht. Diese Biegesteifigkeit geht verloren, wenn die Stiele gestreckt werden. In dieser Arbeit wird ein Modell vorgeschlagen, welches die Unterschiede bei verschiedener Luftfeuchtigkeit auf molekularer Ebene erklärt. Verantwortlich für dieses Verhalten sind Änderungen in der Bindungsenergie von Wasserstoffbrückenbindungen durch die Anwesenheit von Wasser (Wasserstoffbrücken Donor/Akzeptor) im Zusammenspiel mit Disulfidbindungen, die nicht durch das Wasser beeinflusst werden. Basierend auf Konsensussequenzen des veröffentlichten Eierstiel Proteins MalXB2 wurde das Protein N[AS]8C, eine künstlich konstruierte Variante des Proteins, biotechnologisch hergestellt.9 Um einen künstlichen Stiel zu produzieren wurde ein Tropfen einer Lösung von gereinigtem N[AS]8C auf einen Untergrund aufgebracht und anschließend aus dem Tropfen mithilfe einer Pinzette Fäden gezogen. Nach dem Trocknen und Nachbehandeln der Fäden wurden die Eigenschaften der künstlichen sowie der natürlichen Stiele untersucht. Mechanische Analysen zeigten ähnliche Eigenschaften der natürlichen und künstlichen Eierstiele bei 30% relativer Luftfeuchtigkeit, wohingegen die künstlichen Stiele bei 70% und 100% weniger dehnbar waren als die natürlichen. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass in den künstlichen Stielen keine cross-ß Struktur gebildet wurde und somit keine Umformung von cross-ß zu parallel-ß stattfinden konnte. Eine Morphologie mit Potential zur Anwendung in der Zellkultur sind Filme. Da Fibroblasten schlecht auf Filmen aus N[AS]8C adhärieren, wurde versucht, Fibroblasten gezielt auf einem gemusterten Film wachsen zu lassen. Die Grundschicht wurde aus ntagCysC16-c(RGDfK), einer technisch erzeugten Variante eines Spinnenseidenproteins, an welches die Integrin-Erkennungssequenz RGD gekoppelt ist, gegossen. Aufgrund dieser Erkennungssequenz adhärieren Fibroblasten gut auf diesen Filmen. Eine zweite Schicht aus N[AS]8C wurde mithilfe einer PDMS (Polydimethylsiloxan) Maske aufgebracht. Fibroblasten adhärieren auf solchen gemusterten Filmen nur auf den ntagCysC16-c(RGDfK) und nicht auf den mit N[AS]8C bedeckten Bereichen. Eine weitere Besonderheit dieser Filme ist die Möglichkeit, durch Applikation des zweiten Films in Streifenform, Fibroblasten ausgerichtet wachsen zu lassen. Solche Filme könnten für „Tissue engineering“ genutzt werden, um Zelladhäsion zu kontrollieren und eine strukturierte Zellausrichtung zu erhalten. Dies ist essentiell für viele natürliche Gewebe wie Knochen, Muskeln, und Epithelgewebe. Des Weiteren könnten die schwachen Zelladhäsions-Eigenschaften von N[AS]8C Filmen für Beschichtungen, bei denen Zelladhäsion nicht erwünscht ist, wie beispielsweise Stents oder Kathetern, interessant sein.