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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9869
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12123
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 Mai 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Ludwig (Prof. Dr.) Lehle |
| Tag der Prüfung: | 18 April 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Stichwörter / Keywords: | Glykosylierung , Saccharomyces cerevisiae , Leishmania major , Campylobacter jejuni , Homologie <Biologie> , Mensch , Protein N-Glykosylierung , Oligosaccharyltransferase , Stt3 , protein N-glycosylation , oligosaccharyltransferase , Stt3 |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12123 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Protein N-Glykosylierung ist eine essentielle Proteinmodifikation, die von Hefe bis zum Menschen hoch konserviert ist. Hierbei wird zunächst das lipid-gebundene Oligosaccharid (LLO) der Zusam-mensetzung DolPP-GlcNAc2Man9Glc3 assembliert und nachfolgend von einem Membrankomplex, der Oligosaccharyltransferase (OST), auf Asparaginreste der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr naszieren-der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Protein N-Glykosylierung ist eine essentielle Proteinmodifikation, die von Hefe bis zum Menschen hoch konserviert ist. Hierbei wird zunächst das lipid-gebundene Oligosaccharid (LLO) der Zusam-mensetzung DolPP-GlcNAc2Man9Glc3 assembliert und nachfolgend von einem Membrankomplex, der Oligosaccharyltransferase (OST), auf Asparaginreste der Konsensussequenz Asn-X-Ser/Thr naszieren-der Polypeptidketten übertragen. Die OST der Bäckerhefe besteht aus neun Untereinheiten, wobei fünf Untereinheiten für das Wachstum der Zelle essentiell sind. Über die spezifische Funktion der einzel-nen Proteine ist bislang bekannt.
Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von Stt3. Sie ist eine der essentiellen Unter-einheiten der OST und ist mit mehr als 50 % das am höchsten konservierte Protein des Komplexes. Stt3 ist mit elf Transmembranspannen in der ER-Membran verankert und ragt mit seinem löslichen C-Terminus, vermutlich der katalytischen Domäne, ins Lumen des ER.
Die hohe Konservierung erstreckt sich vor allem auf den luminalen Teil von Stt3, in welchem sog. DXD-/DDX-Motive zu finden sind. Wie aus Untersuchungen von Golgi-Glykosyltransferasen bekannt ist, befinden sich die Aspartatreste dieses Motivs im aktiven Zentrum und sind in die Katalyse invol-viert. Mit Hilfe ortsgerichteter Mutagenese wurden konservierte Aspartatreste der Stt3-Untereinheit aus Saccharomyces cerevisiae (S.c.Stt3) ausgetauscht und der Einfluß auf das Wachstum und die Gly-kosylierung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass das in allen Stt3-Homologen vorkommen-de 516WWDYG520 Motiv sowie ein 582DDI584 für die OST-Funktion essentiell sind und mögliche Aspartatreste für die Katalyse darstellen.
Untersuchungen von Stt3 aus dem Parasiten Leishmania major (L.m.Stt3) zeigten, dass es sich um ein funktionelles Homolog von S.c.Stt3 handelt. Es war in der Lage, das Stt3 der Hefe zu ersetzen, und be-wirkte in vivo eine fast vollständige Glykosylierung des Glykoproteins CPY. Messung der OST in vitro wie auch Untersuchungen in vivo in Hefemutanten mit Defekten in der LLO-Assemblierung er-gaben, dass das protozoische Homolog eine breite Substratspezifität besitzt und auch kürzere LLOs der Zusammensetzung DolPP-GlcNAc2Man5-9 mit hoher Effizienz überträgt. Anhand von Blue Native Analysen konnte gezeigt werden, dass L.m.Stt3 in zwei Formen in der ER-Membran vorliegt: In Anwesenheit von Stt3 der Hefe befindet sich L.m.Stt3 außerhalb des OST-Komplexes und überträgt nur unglukosylierte Oligosaccharide. Bei Repression von S.c.Stt3 hingegen wird nur ein Bruchteil des L.m.Stt3 in den Komplex rekrutiert und erlangt dort die Fähigkeit, DolPP-GlcNAc2Man9Glc3 zu trans-ferieren.
Desweiteren wurde das Stt3-Homolog C.j.PglB aus dem Eubakterium Campylobacter jejuni unter-sucht, welches in dem sog. Pgl-Gencluster vorliegt, das alle Komponenten für N-Glykosylierung co-diert. Die Tatsache, dass in diesem Organismus außer Stt3 keine weiteren OST Homologe identifiziert werden können, unterstützt die postulierte katalytische Rolle von Stt3. Expressionsstudien von C.j.PglB in Hefe ergaben, dass C.j.PglB weder in vivo noch in vitro katalytische Aktivität besitzt.
Auch die heterologe Expression des hoch konservierten Stt3-Homolog aus Homo sapiens (H.s.Stt3-A) in Hefe konnte das S.c.Stt3 nicht ersetzen.
Um auszuschließen, dass Probleme beim Einbau der homologen Stt3-Proteine aus Campylobacter, Leishmania und Mensch in den OST-Komplex der Bäckerhefe entstehen und damit die Ursache für die negativen Befunde sind, wurden Fusionskonstrukte zwischen Hefe Stt3 und den anderen Homolo-gen hergestellt. Durch Austausch der Transmembranspannen und der C-terminalen, löslichen Domä-nen der Stt3-Proteine sollte eine mögliche, zu Inaktivität führende Konformationsänderung der Trans-membranspannen umgangen werden. Analysen in der Hefe ergaben jedoch, dass keines der Chimäre katalytische Aktivität zeigte.
Blue Native Analysen von Fusionen zwischen H.s.Stt3-A und S.c.Stt3 ergaben Hinweise, dass das S.c.Stt3 zwischen der zweiten und siebten Transmembranspanne Determinanten enthält, die für den Einbau in den OST-Komplex notwendig sind. In Kombination mit in vivo Aktivitätsanalysen konnte gefolgert werden, dass der N-Terminus bis zur Mitte der zweiten Transmembranspanne zur Ausbil-dung einer katalytisch aktiven Stt3-Struktur benötigt wird.
Mittels eines biochemischen Ansatzes sollte ein OST-Minimalkomplex aus Einzelkomponenten in Li-pidvesikel rekonstituiert werden. Hierzu wurden neben S.c.Stt3 auch zwei weitere essentielle Untereinheiten, Ost1 und Wbp1, heterolog in E.coli oder zellfrei in einem in vitro Transkripitions- und Translationssystem exprimiert und erfolgreich in PE-Vesikeln integriert. Es zeigte sich jedoch, dass weder S.c.Stt3 allein noch in Kombination mit S.c.Ost1 und S.c.Wbp1 enzymatische Aktivität besitzt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Protein N-glycosylation is an essential protein modification and highly conserved in evolution from yeast to man. It starts with the assembly of the lipid-linked oligosaccharide (LLO), DolPP-GlcNAc2Man9Glc3, which is finally transferred to asparagines of the consensus sequence Asn-X-Ser/Thr of nascent polypeptide chains by a membrane complex, the oligosaccharyltransferase (OST). OST of baker´s ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Protein N-glycosylation is an essential protein modification and highly conserved in evolution from yeast to man. It starts with the assembly of the lipid-linked oligosaccharide (LLO), DolPP-GlcNAc2Man9Glc3, which is finally transferred to asparagines of the consensus sequence Asn-X-Ser/Thr of nascent polypeptide chains by a membrane complex, the oligosaccharyltransferase (OST). OST of baker´s yeast is composed of nine subunits, five of them being essential for growth. So far, only little is known about the specific function of each protein.
This work aimed at the functional characterization of Stt3. It is one of the essential subunits of OST and represents the most conserved protein of the complex comprising more than 50 % homology. Stt3 spans the ER membrane with eleven transmembrane domains und faces the lumen of the ER with its soluble C-terminus.
The high conservation of Stt3 is found predominantly in the luminal part, which contains so called DXD-/DDX-motifs. As known from studies of Golgi glycosyltransferases, these aspartates of this motiv localize to the active site, where they are involved in catalysis. By means of site-directed mutagenesis, conserved aspartates of Stt3 from Saccharomyces cerevisiae (S.c.Stt3) were exchanged and their influence on growth and glycosylation tested. It could be demonstrated that the motiv 516WWDYG520, which is present in all Stt3-homologs, as well as the 582DDI584 sequence are essential for the function of the OST and represent possible aspartates for catalysis.
Studies of Stt3 from the parasite Leishmania major (L.m.Stt3) revealed that it is a functional homolog of S.c.Stt3. L.m.Stt3 was able to replace Stt3 from yeast and showed nearly complete glycosylation of the glycoprotein CPY in vivo. Measuring of the OST in vitro as well as studies in vivo in yeast mutants with defects in the LLO assembly indicated that the protozoan homolog exhibits broad substrate specificity and transfers with high efficiency also shorter LLOs, composed of DolPP-GlcNAc2Man5-9. Blue Native analysis showed that L.m.Stt3 exists in two forms in the ER membrane: In the presence of Stt3 from yeast, L.m.Stt3 is outside the OST-complex and transfers only unglucosylated oligosaccharides. While S.c.Stt3 being repressed, only part of L.m.Stt3 is recruited to the complex, where it acquires the ability to transfer DolPP-GlcNAc2Man9Glc3.
Furthermore, the Stt3-homolog C.j.PglB of the Eubacteria Campylobacter jejuni was studied, which is present in the so called Pgl gene cluster encoding all components necessary for N-glycosylation. The fact that beside Stt3 no other OST homologs can be identified in C. jejuni, promotes the postulated catalytical part of Stt3. However, expression studies of C.j.PglB in yeast showed that the Stt3 homolog does not possess catalytical activity both in vivo and in vitro.
The heterologous expression of the highly conserved Stt3 homolog from Homo sapiens (H.s.Stt3-A) in yeast could not replace S.c.Stt3.
To exclude problems incorporating the Stt3 homologs from Campylobacter, Leishmania and human in the OST-complex of baker´s yeast and being the reason for the negative results, fusion constructs between yeast Stt3 and the other homologs were generated. By exchanging the transmembrane spans and the C-terminal, soluble domains of the Stt3-proteins, divergent conformation of the transmembrane domains should be avoided. Analysis in yeast however showed that none of the chimeras was catalytically active.
Blue Native analysis of fusions between H.s.Stt3-A and S.c.Stt3 indicated that S.c.Stt3 contains determinants between the second and the seventh transmembrane span, which are essential for incorporation into the OST-complex. In combination with in vivo activity analysis it could be deduced that the N-terminus up to the middle of the second transmembrane span is needed for formation of a catalytically active Stt3.
In a biochemical approach it was attempted to reconstitute an OST minimal complex in lipid vesicles made from single components. For this S.c.Stt3 and two other essential subunits, Ost1 and Wbp1, were heterologously expressed in E. coli or by cell free in vitro transcription and translation and successfully integrated in PE-vesicles. Neither S.c.Stt3 alone, nor in combination with S.c.Ost1 and S.c.Wbp1, showed enzymatic acitivity.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:21
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