| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (10MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9376
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12103
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 Januar 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Michael (Prof. Dr.) Thomm |
| Tag der Prüfung: | 31 Januar 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | Biochemie , Molekularbiologie , Archaebakterien , Transkription <Genetik> , Startreaktion , Pyrococcus furiosus , Transkriptionsfaktor , , biochemistry , molecular biology |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12103 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die große Ähnlichkeit der Komponenten des archaeellen Transkriptionssystems mit dem eukaryotischen polII System ist bereits seit längerem bekannt. Dank der geringeren Komplexität der archaeellen Transkriptionsmaschinerie und der Möglichkeit, die Pyrococcus furiosus (Pfu) RNA Polymerase aus 11 rekombinanten Untereinheiten zu rekonstituieren, war es möglich, im Rahmen dieser Arbeit tiefere ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die große Ähnlichkeit der Komponenten des archaeellen Transkriptionssystems mit dem eukaryotischen polII System ist bereits seit längerem bekannt. Dank der geringeren Komplexität der archaeellen Transkriptionsmaschinerie und der Möglichkeit, die Pyrococcus furiosus (Pfu) RNA Polymerase aus 11 rekombinanten Untereinheiten zu rekonstituieren, war es möglich, im Rahmen dieser Arbeit tiefere Einblicke in die Initiation der Transkription zu gewinnen.
So wurde im einzelnen dokumentiert, dass die Untereinheit E� für die Transkription bei niedrigen Temperaturen benötigt wird, während sie unter optimierten in vitro Inkubations-bedingungen nicht essentiell ist. Die E�-induzierte Stimulation der Transkription erfolgt unabhängig von der Anwesenheit der Untereinheit F, das keine stimulierende Wirkung auf die Transkription hat. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der aktivierende Effekt von E� auf eine Rolle der Untereinheit bei der Ausbildung des offenen Komplexes im Bereich des Transkriptionsstartpunkts und stromabwärts davon zurückzuführen ist.
Der Transkriptionsfaktor E (TFE) wird für die basale archaeelle Transkription in vitro nicht unbedingt benötigt. Dennoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TFE eine duale Rolle bei der Initiationsreaktion spielt. Zum einen wurde eine stimulierende Wirkung von TFE auf die Transkription nachgewiesen, die E�-abhängig ist und in Kombination mit E�/F zu einer 25-fachen Aktivierung des Core-Enzyms der RNAP führte sowie dass dieser Effekt höchst-wahrscheinlich auf der Stabilisierung und dem aktiven Öffnen der stromaufwärts-Grenze der Transkriptionsblase beruht. Die hier präsentierten Ergebnisse, dass TFE an einzelsträngige DNA binden kann und eine hohe Affinität zu vorgeöffneten DNA-Bereichen aufweist, sowie Studien der Arbeitsgruppe von Mike Bartlett (PSU, Portland, Oregon, USA) dokumentieren eindeutig, dass TFE die Transkriptionsblase durch direkte Bindung an den nicht kodierenden Strang im Bereich der Blase stabilisiert.
Des Weiteren konnte eine E� unabhängige Wirkung von TFE auf die Stabilität von offenen Komplexen beobachtet werden. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass TFE zusätzlich als Brücken-bildenden Faktor zwischen TBP und der RNAP fungiert. Wahrscheinlich führt die Kombination beider Rollen von TFE zu der TFE-induzierten Stimulation der Synthese von abortiven 5 nt RNA-Produkten. Zusammengenommen schlagen die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ein Modell für die Initiation der Transkription vor, bei dem das E�/F-Heterodimer und TFE bedeutende Funktionen bei der Ausbildung des vollständigen offenen Komplexes innehaben.
In dieser Arbeit konnte zudem erstmals dokumentiert werden, dass TFE nicht nur wie TFIIE ausschließlich als Initiationsfaktor wichtige stabilisierende Funktionen übernimmt, sondern auch in Elongationskomplexen vorliegt und dort eine wichtige Funktion innehat. Die Analyse von Komplexen, die an Position +20 pausiert wurden ergab eine TFE-abhängige, gesteigerte Wiederaufnahme-Effizienz der pausierten RNAP sowie eine gesteigerte KMnO4-Sensitivität der T-Positionen in der entsprechenden Transkriptionsblase. Der direkte Nachweis von TFE in den pausierten ternären Komplexen erfolgte durch spezifische Cross-Links von TFE an die Positionen +9, +11 und +16 des nicht kodierenden Strangs, die auch Evidenz dafür erbrachten, dass TFE die Konformation von Elongationskomplexen beeinflusst. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass TFE nur an Präinitiationskomplexe binden kann und nicht später mit bereits elongierenden Komplexen in Wechselwirkung treten kann.
An pausierten frühen Elongationskomplexen konnte außerdem beobachtet werden, dass es während des Übergangs von Initiation zu Elongation zu einer Konfomationsänderung der RNAP kommt. Während die RNAP-Untereinheit H in Initiationskomplexen die stromabwärts-Grenze des Komplexes darstellt, interagiert H in Elongationskomplexen mit der DNA direkt stromabwärts des aktiven Zentrums. Diese Position entspricht der Position des eukaryotischen Homologs von H, der C-terminalen Domäne von Rpb5 in polII-Komplexen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem die Funktion des konservierten B-Finger Motivs im N-terminalen Bereich von TFB analysiert werden, das dem Pfu TFB2 fehlt. Mit TFB2 gebildete Initiationskomplexe weisen einen Defekt bei der Stabilisierung von offenen Komplexen auf, der durch die Verwendung von Heteroduplex-DNA-Matrizen umgangen werden kann. Die geringe Aktivität von TFB2-induzierten Transkriptionskomplexen an Duplex-DNA-Matrizen konnte durch Zugabe von TFE größtenteils kompensiert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das B-Finger Motiv der N-terminalen Domäne von TFB einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des frühen offenen Komplexes hat und dass die stabilisierende Funktion von TFE einen Defekt in der B-Finger-induzierten Stabilisierung der Transkriptionsblase kompensieren kann.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The homology between components of the archaeal transcription machinery and the eukaryotic polII system is well-documented. The archaeal transcription system is said to be a simplified version of the eukaryotic one and the ability to use a reconstituted 11 subunit Pyrococcus furiosus (Pfu) RNA polymerase (RNAP), assembled from fully recombinant subunits, has shed new light on the process of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The homology between components of the archaeal transcription machinery and the eukaryotic polII system is well-documented. The archaeal transcription system is said to be a simplified version of the eukaryotic one and the ability to use a reconstituted 11 subunit Pyrococcus furiosus (Pfu) RNA polymerase (RNAP), assembled from fully recombinant subunits, has shed new light on the process of initiation and early elongation in archaeal/eukaryotic-type transcription systems.
The present work documents that RNAP subunit E� is essential for transcription at low temperatures, while it is dispensable under optimized in vitro conditions. The stimulatory effect of E� on transcription activity is independent of the presence of subunit F, which alone has no effect on transcription. At low temperatures, E� is essential for the formation of the open complex, in particular the extension of the transcription bubble in the region of the transcription start site and downstream of it.
Although the archaeal transcription factor E (TFE) is not necessary for in vitro transcription, the present work suggests a dual role of TFE during initiation.
First, TFE has a broad simulating effect on the E�-dependent activation of the core enzyme�s activity. In the presence of E�/F, TFE increased the activity of the core enzyme by a factor of 25 and this effect is due to a stabilizing effect of TFE on the transcription bubble as well as an active role for TFE in opening the promoter DNA at the upstream end of the bubble. Results presented in this work show that TFE is able to bind to single stranded DNA and displays high affinity to partly preopened DNA-regions. Together with results of Mike Bartlett�s group (PSU, Portland, Oregon, USA), this suggests that stabilizing of the transcription bubble by TFE is based on direct protein/DNA contacts of TFE with the surface-exposed non-coding strand in the region of the bubble.
Second, an E�-independent effect of TFE on the stability of binary complexes formed by the core enzyme was observed in heparin competition assays, suggesting TFE to be a bridging-factor between the promoter-bound TBP and the RNAP. Most likely, both effects in concert are responsible for a TFE-induced significant accumulation of short abortive transcripts with a length of 5 nt. Taken together, the results presented in this work suggest a detailed model for transcription initiation and dissect important roles of the E�/F-heterodimer and TFE during formation of the open complex.
This work gives evidence that unlike its eukaryotic homolog TFIIE, TFE is not only an initiation factor contributing important effects on the stability of initiation complexes but also is a part of elongation complexes and confers an important functional effect on the ternary complexes. Analysis of the resumption of transcription of paused elongation complexes revealed a significant TFE-induced stimulatory effect on the resumption efficiency of the complexes. KMnO4-footprinting assays were used to document that the increase of resumption efficiency is caused by a stabilization of the transcription bubble by TFE. The evidence of TFE being part of elongation complexes comes from site-specific cross-links at the positions +9, +11, and +16 at the non coding strand. Additionally, TFE affects the conformation of the ternary elongation complex. This work documents that the recruitment of TFE to the initiation complex is a prerequisite for the effect of TFE in elongating complexes.
The analysis of elongation complexes paused in the early phase of elongation also revealed a partial reorganization of the RNAP during transition from initiation to elongation. The RNAP subunit H, which is located at the downstream border in P. furiosus initiation complexes, is repositioned and located immediately downstream of the active centre of paused elongation complexes. This positioning resembles the location of the eukaryotic homolog of H, the C-terminal part of Rpb5 in polII complexes.
The present work also uncovers the function of the highly conserved N-terminal B-finger motif in TFB, which is naturally lacking in Pfu TFB2. Initiation complexes assembled with TFB2 show a TFB2-specific defect in stabilization of the open region and this effect can be bypassed with a pre-formed transcription bubble. The low activity of TFB2-induced complexes in bubble stabilization and transcription can be partly relieved by TFE. The results presented here indicate that the TFB B-finger motif is important for stabilization of early initiation complexes, and that stabilizing effect of TFE can compensate for defects caused by the lack of the B-finger.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:24
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