| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (6MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-5370
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10387
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 17 Mai 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Claudia (Prof. Dr.) Steinem |
| Tag der Prüfung: | 27 Juni 2005 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Stichwörter / Keywords: | Bakteriorhodopsin , Chlamydomonas reinhardii , Biologisches Modell , Poröse Membran , Aluminate , Adsorption , Funktionalisierung <Chemie> , Proteine , Photoresist , Nanoporöser Stoff , Modellsystem , lichtaktiviert , model system , light-activated |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10387 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Porenüberspannende Membranen auf der Basis poröser Aluminate stellen ein neues Modellsystem für biologische Membranen dar. In dieser Arbeit konnte die Eignung dieses System zur Untersuchung lichtaktivierter Proteine gezeigt werden. Ein wichtiger Aspekt dabei war die Charakterisierung und Reduzierung des Photoartefaktes. Als Modellprotein wurde mit Bacteriorhodopsin ein gut charakterisiertes und ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Porenüberspannende Membranen auf der Basis poröser Aluminate stellen ein neues
Modellsystem für biologische Membranen dar. In dieser Arbeit konnte die
Eignung dieses System zur Untersuchung lichtaktivierter Proteine gezeigt werden.
Ein wichtiger Aspekt dabei war die Charakterisierung und Reduzierung des
Photoartefaktes. Als Modellprotein wurde mit Bacteriorhodopsin ein gut charakterisiertes und äußerst robustes Protein verwendet. Drei Strategien, die sich in der Art der Oberflächenfunktionalisierung unterschieden, wurden eingesetzt, um Bacteriorhodopsin über elektrostatische Wechselwirkungen an die Oberfläche der Aluminate zu adsorbieren. Die erste Strategie bestand in der Chemisorption von Aminoalkanthiolen an die Goldelektrode, die zweite in der Präparation von Polyelektrolyt-Multischichten. Bei der dritten Beschichtungsstrategie wurden die Poren mit nano-BLMs überspannt. Bacteriorhodopsin wurde entweder in Form von Purpurmembranfragmenten (Strategie 1 und 3) oder rekonstituiert in Lipidvesikel (Strategie 2) an die Substratoberfäche adsorbiert. Quarzmikrowaage- sowie Photostrom-Messungen zeigten, daß unter Verwendung planarer Goldelektroden als Festkörpersubstrate bei allen Strategien das Protein an der Oberfläche immobilisert und bR-induzierte Photoströme gemessen werden konnten.
Bei Verwendung der porösen Aluminate bestand der erste Schritt stets in der
Beschichtung der Porenstege mit einer dünnen Goldschicht. Zunächst wurden
Substrate mit geschlossenen Poren verwendet. Es zeigte sich bei Immobilisierung
von bR an die Aminoalkanthiol-beschichtete Oberfläche, daß auch unter Variation
des Herstellungsprozesses der Aluminate das vermeintliche bR-Signal nicht
vom Photoartefakt diskriminiert werden konnte. Auch bei der zweiten Strategie
konnten aufgrund fehlender kapazitiver Kopplung von bR-Vesikeln an die
Oberfläche keine signifikanten Photoströme gemessen werden. Das Auftreten des
Photoartefaktes in diesem System wurde der lichtinduzierten Aufladung der Oxid-
Metall-Grenzflächenkapazität zugeordnet. Daher wurden bei der dritten Strategie
offene Poren verwendet, die durch Ablösen des Aluminiums und anschließendes
Entfernen des Barriereoxids durch chemisches Ätzen hergestellt wurden. Die Poren
wurden mit Octadecylamin-haltigen nano-BLMs überspannt. Photoartefakte
wurden nicht mehr beobachtet oder waren vernachlässigbar klein. Nach Adsorption
von Purpurmembranfragmenten konnte die lichtinduzierte Protonenpumpaktivität
von Bacteriorhodopsin nachgewiesen werden, die sich im Auftreten transienter
Ströme beim Ein- und Ausschalten des Lichts äußerte. Das Aktionsspektrum
war im Vergleich zum Absorptionsspektrum des Proteins leicht rotverschoben,
zeigte aber dennoch eindeutig, daß die gemessenen Ströme auf die Aktivität des
Proteins zurückzuführen sind. Durch Messung der Maximalstromdichten und der
Zeitkonstanten der transienten Ströme wurde gezeigt, daß das sogenannte sandwich-Modell � entwickelt für Adsorption von PM an klassische BLMs � auf das
nano-BLM-System übertragen werden kann. Stationäre Ströme wurden gemessen,
nachdem die Leitfähigkeit der Lipidmembran durch Zugabe von CCCP, einem
membranlöslichen Protonencarrier, erhöht wurde. Die Konstanz der stationären
Ströme auch über mehrere Minuten hinweg zeigt, daß Protonentransfer über die
Membran erfolgt und eine ausreichende Protonenleitfähigkeit entlang der Poren
gegeben ist.
Neben Bacteriorhodopsin wurde ein zweites lichtaktiviertes System an nano-
BLMs adsorbiert. Durch kapazitive Kopplung der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii an die Membran konnten erneut lichtinduzierte Photoströme gemessen werden, die auf die Öffnung von Kationenkanälen im Augenfleck der Zelle zurückzuführen sind. Ein Adaptionsverhalten der Stromantwort wurde beobachtet.
Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, daß ein Modellsystem, basierend auf porenüberspannenden Membranen in Zukunft durchaus einen Beitrag zur Charakterisierung von lichtaktivierten Proteinen und anderen lichtgesteuerten membrangebundenen Prozessen leisten kann.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Pore-suspending membranes based on porous alumina serve as a new model system for biological membranes. Within this study the suitability of the system for the investigation of light-activated proteins was shown. Because of its unique stability the well characterised protein bacteriorhodopsin was chosen as a model protein. To adsorb the protein to the surface of the alumina by electrostatic ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Pore-suspending membranes based on porous alumina serve as a new model system
for biological membranes. Within this study the suitability of the system
for the investigation of light-activated proteins was shown. Because of its unique stability the well characterised protein bacteriorhodopsin was chosen as a model protein. To adsorb the protein to the surface of the alumina by
electrostatic interactions three strategies, differing in the way of surface functionalisation, were used. The first one was based on chemisorption of aminoalkanethiols, the second one on the preparation of polyelectrolyte multilayers. In the third strategy nano-BLMs suspended the pores of the substrate. Bacteriorhodopsin was adsorbed using purple membranes (strategy 1 and 3) or bR-reconstituted lipid vesicles (strategy 2). Quarz crystal microbalance and photo current measurements showed that using planar gold electrodes as a solid support all strategies were suitable for immobilising the protein on the surface resulting in bR-induced photo currents.
When using porous alumina substrates a thin gold layer was sputtered on top
in a first step. Initially pores with underlying aluminum and barrier oxide layers were used. Preparing the surface with aminoalkanethiols it turned out that the photoartefact and the supposed bR-signal could not be discriminated. This observation did not depend on the way of fabricating the substrate. Due to the missing capacitive coupling of the bR-vesicles to the surface no significant photocurrents were recorded using the second strategy either. The charging of the oxide-metal interface was thought to be responsible for the occurence of photoartefacts in this system. For this reason the aluminum and the barrier oxide were removed off the porous alumina substrates used in the third strategy. Afterwards the pores were suspended with octadecylamin-containing nano-BLMs. Photoartefacts were no longer detected or very small. After adsorption of purple membranes transient currents were observed upon switching on and off the light, respectively, which was attributed to bacteriorhodopsin activity. An action spectrum was recorded which was slightly red-shifted but nevertheless unambiguously showed that the photocurrents reflect the electrical activity of the protein. By measuring the lightdependent maximum current densities and time constants of the transient currents
it was demonstrated that the so-called sandwich-model, developed for the
adsorption of PM to classic BLMs, can be transfered to the nano-BLM-system.
Stationary currents were observed after increasing the conductance of the lipid
bilayer by addition of the membrane-soluble protonophore CCCP. These currents
were stable for several minutes indicating that protons are transported across the lipid bilayer and that there is a suffcient proton conductance along the pores.
A second light-activated system was adsorbed to the nano-BLMs. By capacitive
coupling of the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii light-induced
currents were observed which can be attributed to the opening of cation channels
in the eyespot of the cell. Upon multiple light exposure an adaption behaviour of the current response was observed.
The results presented in this work show that in the future a model system based
on pore-suspending membranes can contribute to the characterisation of light activated proteins and further light-controlled membrane-related processes.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:07
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik