In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen funktioneller Bereiche des Adenovirus Typ 5 E1B-55kDa-Proteins

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-3611
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.10252

Zeller, Thomas

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 21 Feb 2005 06:48

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	20 Februar 2005
Begutachter (Erstgutachter):	Thomas (PD Dr.) Dobner
Tag der Prüfung:	20 Februar 2004
Institutionen:	Biologie und Vorklinische Medizin
Stichwörter / Keywords:	Adenovirus 5 , Transformation <Genetik> , Replikation , Virusvektor , Protein p53 , Virusmutanten , Klonierungssystem , Adenoviruspunktmutanten , adenovirus 5 , transformation , replikation , virusvektor , cloningsystem
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	10252

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

Das 55kDa-Genprodukt der frühen Transkriptionseinheit 1B (E1B-55kDa) von Adenovirus Typ 5 ist ein multifunktioneller Regulator der Zellzyklus-unabhängigen adenoviralen Replikation. Dabei kontrolliert es zahlreiche Prozesse wie z.B. die proteolytische Degradation des Tumorsuppressorproteins p53, den selektiven viralen mRNA Transport ins Zytoplasma und das Abschalten der Wirtsproteinsynthese. Zusätzlich stimuliert E1B-55kDa in Kooperation mit E1A die onkogene Transformation primärer Rattenzellen. Dazu bindet E1B-55kDa an p53 und inhibiert über seine intrinsische Repressorfunktion die Transaktivierung p53-regulierter Gene.
In der vorliegenden Arbeit habe ich die Bedeutung von zwei neu identifizierten Regionen im E1B-55kDa � eine BC-Box-Sequenz und ein putatives Ringfinger-Motiv � für das onkogene Potenzial von E1B-55kDa untersucht. Die BC-Box-Sequenz ist an der Bindung von p53 beteiligt und trägt somit p53-abhängig zur E1A-induzierten Transformation bei. Das Ringfinger-Motiv hingegen spielt keine Rolle für die Interaktion mit p53. Trotzdem ist die Region von E1B-55kDa essentiell für die vollständige Transformation von Zellen in Kultur. Ich konnte somit zum ersten Mal Bereiche im E1B-55kDa identifizieren, die p53-unabhängig zur vollständigen Transformation beitragen.
Um die interessantesten Mutanten in der BC-Box und im Ringfinger-Motiv im viralen Kontext zu untersuchen bzw. um die Auswirkungen von Mutationen im nukleozytoplasmatischen Pendelmotiv von E1B-55kDa im lytischen Infektionszyklus zu analysieren, habe ich ein direktes Klonierungssysthem für Adenoviruspunktmutanten etabliert und die entsprechenden Virusmutanten hergestellt und untersucht. Überraschenderweise beeinflusste keine der eingeführten Mutationen die Expression der untersuchen viralen Proteine und die Virusmutanten produzierten annähernd viele Nachkommenviren wie das Wiltyp-Virus. Obwohl die Mutationen keine Einfluss auf den lytischen Infektionszyklus hatten, konnte ich zum erstem Mal zeigen, dass E1B-55kDa auch in virusinfizierten Zellen zwischen Zellkern und Zytoplasma über ein Leucin-reiches nukleäres Exportsingal (NES) und durch die Konjugation mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein (SUMO1) pendelt.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

The human subgroup C adenoviral E1B-55kDa protein is a multifunctional regulator of cell cycle-independent adenovirus replication that controls several processes, including proteolytic degradation of the tumor suppressor protein p53, selective viral late mRNA transport to the cytoplasm, and shut-off of host cell protein synthesis. Additionally E1B-55kDa stimulates in combination with E1A the oncogenic transformation of primary rat cells. It has been suggested that this activity of E1B-55kDa is due to its ability to interact with p53 and to actively represses the transactivation of p53-regulated genes.
In the present study I investigated the importance of two new identified conserved regions in the E1B-55kDa � a BC-box sequence and a putative ringfinger motif - on the oncogenic potential of E1B-55kDa. The BC-box sequence of E1B-55kDa was directly involved in the binding of p53 and the respective mutants could not repress the transactivation of the p53 target genes and therefore these mutants were not able to support the E1A-induced transformation. The ringfinger motif on the other hand was not involved in the binding of p53. Nonetheless this region of E1B55-kDa is essential for complete transformation of cells in culture. For the fist time I identified regions in the E1B-55kDa that are important for the complete transformation of primary cells in a p53-independent manner.
To investigate the most interesting mutants in the BC box and in the ringfinger motif in the viral context and to examine the effects of mutations in the nucleocytoplasmic shuttling domain of E1B-55kDa in the lytic infection cycle, I established a direct cloning method for adenovirus pointmutants and analysed the respective virusmutants. Surprisingly the investigated mutations in the E1B-55kDa did not affect the expression of the analysed viral proteins and the pointmutated viruses produced as much progeny virus as the wildtype virus. Although the mutations did not affect the lytic infection cycle I was able to show for the first time that E1B-55kDa shuttles in infected cells between the nucleus and the cytoplasm through a leucine-rich nuclear export signal (NES) and the conjugation of the small ubiquitin-related modifier protein 1 (SUMO1).

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