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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-3448
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10246
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 Januar 2005 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Otto S. (Prof. Dr.) Wolfbeis |
| Tag der Prüfung: | 27 Januar 2004 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, ehemals Prof. Wolfbeis) |
| Stichwörter / Keywords: | Zeitauflösung , Fluoreszenz , Peroxidase , Citronensäurezyklus , Chiralität <Chemie> , , Time-resolved fluorescence , peroxidase , citrate cycle , imaging , chirality |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10246 |
Zusammenfassung (Englisch)
The dissertation describes the development of europium-derived fluorescence probes for biological substances in aqueous solution. A scheme is shown in Fig. 7.1. Europium-tetracycline-hydrogen peroxide and europium-tetracycline-hydroxy acid probes have the merits of large Stokes´ shift, line-like emission and long lifetime. In chapter 1 the mechanism of lanthanide complex luminescence is ...
Zusammenfassung (Englisch)
The dissertation describes the development of europium-derived fluorescence probes for biological substances in aqueous solution. A scheme is shown in Fig. 7.1. Europium-tetracycline-hydrogen peroxide and europium-tetracycline-hydroxy acid probes have the merits of large Stokes´ shift, line-like emission and long lifetime.
In chapter 1 the mechanism of lanthanide complex luminescence is introduced. The three main approaches for time-resolved fluorescence in heterogeneous phase, namely direct lanthanide chelate label-based luminescence assay (DLCLLA), dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay (DELFIA) and enzyme-amplified lanthanide luminescence (EALL) are reviewed.
The time-resolved assay of the activity of peroxidase (POx) by the fluorescent probe europium-tetracycline-hydrogen peroxide (EuTc-HP) is presented in chapter 2. At first, the catalytic mechanism of POx, as a widely studied enzyme across a range of scientific disciplines, is discussed. Quantification is based on the finding that the strongly fluorescent complex EuTc-HP (which is in equilibrium with unbound H2O2) is indirectly decomposed by POx to give the weakly fluorescent EuTc following the consumption of H2O2 in MOPS buffer at neutral pH. The rate of consumption of the EuTc-HP as monitored via the decrease in fluorescence intensity (or change in decay time) is a direct parameter for the activity of the POx. The time-resolved assay can detect as little as 1.0´ 10-5 Units/ mL of POx, with a dynamic range from 4.0 ´ 10-5 to 5.9 ´ 10-3 Units/mL. The effects of cyanide, hydroxylamine, and azide (all known to inhibit POx) are also studied.
When POx is exploited as a label and EuTc-HP as a probe, ELISA and oligonucleotide hybridization assays can be developed as shown in chapter 3. The time-resolved fluorescent assays for biological specimens have advantages over the conventional steady-state assays. Two schemes for POx-ELISA, sandwich and direct, have been investigated. The linear range is from 0.1 to 8.0 ng/ml for IgG in POx-sandwich ELISA, with 0.1 ng/ml of the limit of detection in time-gated method. EuTc-HP also can be used as a reversible molecular sensor for the imaging of POx-ELISA. The competitive oligonucleotide hybridization assay by the POx label is discussed as well.
The direct fluorescence detection and imaging of citrate are demonstrated in chapter 4. The method is based on the fact that the weakly fluorescent europium-tetracycline (EuTc) complex reversibly associates with citrate to form the strongly fluorescent europium-tetracycline-citrate (EuTc-Cit) complex in HEPES buffer at pH 8.0. Average fluorescence lifetime is also increased from 44 µs (for EuTc) to 88 µs (for EuTc-Cit). Steady-state fluorometry, TCSPC, time-resolved fluorometry and RLD imaging have been used in citrate determination. The time-resolved assay has a dynamic response between 1.6 x 10-7 and 5.6 x 10-5 M, with a detection limit of 6.0 x 10-8 M for citrate. Compared with other main analytical methods for citrate, it is the most sensitive and simplest scheme available up to now. Different tetracycline derivatives are also studied. In addition, this probe is simple to prepare, stable both in solution and in solid , and compatible with the blue laser diodes.
The Krebs cycle, a key series of metabolic reactions in aerobic cellular respiration, is occurring in the mitochondria of animals and plants. Fluorescence imaging of main intermediates in the Krebs cycle and the some bioprocesses of the intermediates are depicted for the first time in chapter 5. Intermediates, i.e. oxaloacetate, citrate, isocitrate, a-ketoglutarate (KG), succinate, fumarate and L-malate, can reversibly associate with EuTc to form EuTc-L complexes having different fluorescent intensities and lifetimes in neutral pH. The steady-state fluorescence intensity and rapid lifetime determination imaging have been employed in the visualization of the Krebs cycle. The stepwise detection of the formation and decomposition of intermediates can be performed via kinetic fluorescence changes. In addition, dual fluorescence method, monitoring both NADH and EuTc-L, is exploited.
Fluorescence chirality sensing is presented in chapter 6. EuTc as a lanthanide chelate is employed for the fluorescence discrimination of enantiomeric malates in aqueous solution. The fluorescence discriminating ability (FL � F0) / (FD � F0) is 5.9 at 619 nm, which is more sensitive than any other chiral fluorometry for alpha-hydroxy acids reported so far. The average lifetimes and quantum yields of EuTc-L-malate and EuTc-D-malate are 84 and 48 µs, 1.7 % and 0.7 %, respectively. It is important that this probe can be also applied for the time-resolved fluorescent determination of the optical purity (ee %) of malate with 120 µs lag time. Chiral malates can also be achieved by time-resolved imaging. Other chiral alpha-hydroxy acids, lactate and tartrate are also discussed. It is the first report on using lanthanide ternary complexes as a �turn-on� fluorescence chiral molecular sensor.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Dissertation zeigt die Entwicklung und praktische Erprobung von Europium-Komplexen als Fluoreszenzsonden für biologisch aktive Substanzen in wässriger Lösung. Abbildung 7.1 fasst die resultierenden Anwendungsmöglichkeiten zusammen. Europium-Tetracyclin geht Komplexverbindungen mit Wasserstoffperoxid oder Hydroxysäuren ein, die sich in ihren optischen Eigenschaften durch eine große ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die vorliegende Dissertation zeigt die Entwicklung und praktische Erprobung von Europium-Komplexen als Fluoreszenzsonden für biologisch aktive Substanzen in wässriger Lösung. Abbildung 7.1 fasst die resultierenden Anwendungsmöglichkeiten zusammen. Europium-Tetracyclin geht Komplexverbindungen mit Wasserstoffperoxid oder Hydroxysäuren ein, die sich in ihren optischen Eigenschaften durch eine große Stokesssche Verschiebung, eine scharfe Emissionslinie und lange Fluoreszenzabklingzeiten auszeichnen
Im ersten Teil der Arbeit werden die grundlegenden Eigenschaften und Mechanismen der Lumineszenz von Lanthanid-Komplexen erläutert. Im Mittelpunkt stehen dabei die drei wichtigsten Methoden zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen in heterogenen Systemen, zum einen der �direct lanthanide chelate label-based luminenescence assay� (DLCLLA) , zum anderen der �dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay� (DELFIA), und schließlich die �enzyme-amplified lanthanide luminescence� (EALL).
In Kapitel 2 wird ein neuer zeitaufgelöster Fluoreszenztest zur Bestimmung der Aktivität von Peroxidase (POx) eingeführt, der auf dem System Europium-Tetracyclin-Wasserstoffperoxid (EuTc-HP) als molekulare Sonde basiert. Zunächst wird der Katalyse-mechanismus von POx beschrieben, einem Enzym, das in der wissenschaftlichen Forschung bereits eingehend untersucht wurde. Die Quantifizierung der Enzymaktivität erfolgt über den indirekten Abbau des stark fluoreszierenden EuTc-HP-Komplexes. Dieser steht im Gleichgewicht mit ungebundenen H2O2 in der gepufferten Lösung, das durch den enzymatischen Ein-fluss von POx umgewandelt wird. Die Umsatzrate von EuTc-HP kann als direkter Parameter für die Enzymaktivität durch die Abnahme der Fluoreszenzintensität oder Veränderungen in der Fluoreszenzabklingzeit detektiert werden. Der zeitlich aufgelöste Fluoreszenztest hat eine Nachweisgrenze von 1 x 10-5 U/mL POx mit einem dynamischen Messbereich von 4.0 x 10-5 bis 5,9 x 10-3 U/mL. Der Einfluss von Inhibitoren wie Cyanid, Hydroxylamin und Azid auf die Aktivität von POx wurde ebenfalls untersucht.
Wird POx als Biomarker und EuTc-HP als molekulare Sonde eingesetzt, können ELISAs und DNA-Hybridisierungsassays detektiert werden. Kapitel 3 verdeutlicht, dass zeitaufgelöste Fluoreszenztests für Biomoleküle den gebräuchlichen Intensitätsmessungen überlegen sind. Ein Sandwich- und ein direkter POx-ELISA wurden im Rahmen dieses Projekts untersucht. Dabei wurde ein linearer Messbereich für IgG von 0,1 bis 8.0 ng/ml mit einer Nachweisgrenze von 0,1 ng/ml erhalten. EuTc-HP kann auch als reversibler molekularer Sensor für das Imaging von POx-ELISAs verwendet werden. Ein kompetitiver Hybridisierungstest für Oligonukleotide mit Hilfe von POx-Markern wird ebenfalls diskutiert.
Ein direkter Fluoreszenznachweis auf Citrat, einem in der Natur allgegenwärtigen Stoff, mittels bildgebender Verfahren wird in Kapitel 4 entwickelt. Die Methode basiert auf der Fähigkeit des schwach fluoreszierenden Europium-Tetracyclins reversibel Citrat zu binden und dabei einen stark fluoreszierenden Europium-Tetracyclin-Citrat-Komplex (EuTc-Cit) zu bilden. Die mittlere Fluoreszenzlebensdauer wird in Folge ebenfalls von 44 µs (EuTc) auf 88 µs (EuTc-Cit) erhöht. Stationäre Fluorometrie, TCSPC, zeitaufgelöste Fluorometrie und RLD Imaging können so zur Bestimmung von Citrat herangezogen werden. Der zeitaufgelöste Fluoreszenztest ergibt einen dynamischen Messbereich von 1,6 x 10-7 bis 5,6 x 10-5 M bei einer Nachweisgrenze von 6.0 x 10-8 M Citrat. Verglichen mit anderen Bestimmungsmethoden für Citrat ist dies momentan das empfindlichste und einfachste verfügbare analytische Verfahren. Darüber hinaus ist dieser molekulare Sensor einfach zu synthetisieren, stabil sowohl in gelöster als auch in fester Form und kompatibel zur Anregungswellenlänge eines blauen Diodenlasers. Die Eigenschaften anderer Tetracyclin-Derivate wurden ebenfalls untersucht.
Der Citrat (Krebs)-Zyklus ist ein essentieller Bestandteil des aeroben Zellstoffwechsels und findet in den Mitochondrien von tierischen und pflanzlichen Zellen statt. Das Fluoreszenz-Imaging der wichtigsten Zwischenprodukte des Citrat-Zyklus steht im Mittelpunkt von Kapitel 5. Diese Zwischenprodukte wie Oxalacetat, Citrat, Isocitrat, a-Ketoglutarat, Succinat, Fumarat und L-Malat können reversibel an EuTc als weiterer Ligand (L) gebunden werden. Die resultierenden EuTc-L-Komplexe weisen unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten und Abklingzeiten auf. Die Aufnahme der stationären Fluoreszenzintensität einerseits und RLD Imaging andererseits wurden zur Visualisierung dieser Verbindungen eingesetzt. Die Bildung und der Verbrauch der verschiedenen Zwischenstufen kann mit Hilfe kinetischer Fluoreszenzmessungen schrittweise detektiert werden. Zusätzlich kann mit einer dualen Fluoreszenzmethode die Änderung des Gehalts von NADH und EuTc-L gleichzeitig überwacht werden.
Schließlich werden in Kapitel 6 chirale Fluoreszenzsensoren beschrieben. EuTc kann zur Unterscheidung der beiden enantiomeren Formen von Malat in wässriger Lösung benutzt werden. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität nach der Koordination beider Isomerer (FL-F0) / (FD-F0) beträgt 5,9 bei einer Emissionswellenlänge von 619 nm. Das ist ein höherer Faktor als bei allen anderen bekannten chiralen fluorimetrischen Verfahren für alpha-Hydroxysäuren. Die mittleren Fluoreszenzabklingzeiten von EuTc-L-Malat und EuTc-D-Malat betragen 84 bzw. 48 µs, die Quantenausbeuten 1,7 % bzw. 0,7 %. Die enantiomeren Formen von Malat können auch mittels zeitaufgelöstem Fluoreszenzimaging angezeigt werden. Weitere chirale alpha-Hydroxysäuren, sowie Laktat und Tartrat werden ebenso diskutiert. Somit ist diese die erste Arbeit, bei der ternäre Lanthanid-Komplexe als �einschaltbare� molekulare chirale Fluoreszenzsensoren eingesetzt werden.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:28
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