| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10142
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12130
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 Juli 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Stephan (Prof. Dr.) Schneuwly |
| Tag der Prüfung: | 2 Juli 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Stichwörter / Keywords: | Methylierung , Cytokine , Geninaktivierung , Transkription <Genetik> , Genregulation , , methylation , cytokines , gene silencing , transcription , gene regulation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12130 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das stetig zunehmende Wissen um die Struktur und Funktion von Zytokinen, insbesondere ihrer immunmodulierenden Eigenschaften, wecken das Interesse an deren therapeutischer Applikation. Der daraufhin steigende Bedarf an rekombinanten Zytokinen erfordert daher effiziente Strategien für eine optimale Expression in eukaryontischen Zellen. Um den Gefahren einer Genstilllegung durch Methylierung von ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das stetig zunehmende Wissen um die Struktur und Funktion von Zytokinen, insbesondere ihrer immunmodulierenden Eigenschaften, wecken das Interesse an deren therapeutischer Applikation. Der daraufhin steigende Bedarf an rekombinanten Zytokinen erfordert daher effiziente Strategien für eine optimale Expression in eukaryontischen Zellen. Um den Gefahren einer Genstilllegung durch Methylierung von Cytosin-Guanin Dinukleotiden (CpG) zu entgehen, wurden in der Vergangenheit für die rekombinante eukaryontische Expression ausschließlich CpG-freie Varianten des jeweiligen Transgens eingesetzt. Widersprüchlichkeiten CpG-assoziierter Expressionsmuster in der neueren Literatur bildeten die Grundlage für weitere detailliertere Untersuchungen zur Rolle von CpG Dinukleotiden. Ausgehend von verschieden optimierten Genvarianten für vier Zytokine (humanes und murines MIP-1a bzw. GM-CSF) wurden dabei sowohl Unterschiede in der Expressionsmenge analysiert, als auch die dafür verantwortlichen molekularen Mechanismen aufgeklärt.
Am Beispiel des murinen MIP-1a, als biotechnologisch relevantes Protein, wurde der Einfluss von CpG Dinukleotiden im offenen Leserahmen eines Transgens auf seine Expression genauer untersucht. Zu diesem Zweck wurde die wildtypische Nukleinsäuresequenz des murinen MIP-1a modifiziert: Neben einem kodonoptimierten Gen wurden eine CpG-freie sowie eine CpG-maximierte Genvariante hergestellt. Anhand dieser vier Genvarianten konnte im Folgenden gezeigt werden, dass intragenische CpG Dinukleotide einen positiven Einfluss auf die Expression ausüben (Steigerung um Faktor zwölf), während die CpG Depletion zu starken Expressionsverlusten führt (bis zu zwanzigfache Reduktion). Dieser Zusammenhang zwischen CpG Dinukleotiden und Expression konnte sowohl für die transiente Expression in H1299-Zellen wie auch für die stabile Expression des Zytokines in CHO-Zellen (chinese hamster ovary, Flp-In-System) beobachtet werden, wobei für alle Genvarianten die gleiche Translationseffizienz ermittelt wurde. Ferner konnte durch quantitative real time PCR gezeigt werden, dass der CpG-vermittelte Effekt in den stabil MIP-1a exprimierenden Zellen bereits auf Ebene der �steady-state� RNA im Zellkern und im Zytoplasma nachzuweisen ist. Ein ungleicher Export der mRNA-Varianten aus dem Zellkern, fehlerhafte Spleißereignisse oder eine veränderte RNA-Stabilität konnten als Ursache für die divergierenden RNA-Niveaus ebenso ausgeschlossen werden. Die Analyse der de novo RNA-Syntheserate mittels �nuclear run-on� Assays offenbarte eine direkte und positive Korrelation zwischen der Anzahl intragenischer CpG Dinukleotide im offenen Leserahmen und einer Erhöhung der transkriptionellen Aktivität. Transiente Transfektionen in vitro methylierter Plasmide sowie die Bestimmung des Methylierungsstatus der stabil exprimierenden Zelllinien mit Hilfe der Bisulfitsequenzierung ergab darüber hinaus, dass nur unmethylierte CpG Dinukleotide diesen Effekt vermitteln. Für das humane CFP1 Protein (CXXC-Zinkfinger-Protein 1) wurde bereits beschrieben, dass es ausschließlich an unmethylierte CpG Dinukleotide bindet und daraufhin die Transkription aktiviert. Die Existenz eines Homologs in den stabilen CHO-Zelllinien, sowie die Interaktion der DNA-bindenden Domäne des humanen CFP1 mit der CpG-maximierten Zytokingenvariante konnten in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Der Beitrag des CFP1 Proteins an der Transkription der MIP-1a Genvarianten wurde in �knock down�-Experimenten durch shRNA-Transfektionen überprüft, es konnte jedoch keine abschließende Aussage getroffen werden.
In dieser Arbeit konnte der positive Einfluss unmethylierter CpG Dinukleotide im offenen Leserahmen auf die Expression eines Transgens, am Beispiel des murinen MIP-1a, klar dargelegt werden. Für die Entwicklung effizienter eukaryontischer Expressionssysteme sollte daher künftig auch die intragenische CpG Maximierung des zu exprimierenden Gens in Erwägung gezogen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The growing knowledge of structures and functions of cytokines, especially their immune modulating properties, draws interest to their therapeutic application. The resulting increase in consumption of recombinant cytokines demands efficient strategies for an optimal expression in eukaryotic cells. To circumvent the dangers of gene silencing mediated by methylation of cytosine-guanine ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The growing knowledge of structures and functions of cytokines, especially their immune modulating properties, draws interest to their therapeutic application. The resulting increase in consumption of recombinant cytokines demands efficient strategies for an optimal expression in eukaryotic cells. To circumvent the dangers of gene silencing mediated by methylation of cytosine-guanine dinucleotides (CpG), only CpG-free variants of the respective gene were used for expression in the past. Discrepancies of CpG associated expression patterns in recent publications provided the basis for a more detailed analysis concerning the influence of CpG dinucleotides on expression. Based on differentially optimized gene variants of the human and murine cytokine genes coding for MIP-1a and GM-CSF, differences in expression levels as well as the responsible molecular mechanisms were elucidated.
Using the example of the murine MIP-1a, which is a biotechnological promising protein, the influence of CpG dinucleotides within the open reading frame of a transgene on its expression was analysed in more detail. For this purpose, the wild type nucleotide sequence of the murine MIP-1a was modified. Among a codon-optimized gene, a CpG-free as well as an CpG-maximized gene variant were synthesized without altering the amino acid sequence. By means of these four gene variants, it could be shown, that intragenic CpG dinucleotides have a positive effect on expression (increase by a factor of twelve), while CpG depletion lead to a dramatic decrease of expression (decrease by a factor of twenty). This correlation between CpG dinucleotides and expression could be observed following transient expression in H1299 cells, and stable expression of the cytokines in CHO cells (Chinese hamster ovary, Flp-In system), while the translational efficiency was determined to be the same for all gene variants. Furthermore, quantitative real-time PCR demonstrated that the CpG mediated effect on expression levels of the stably MIP-1a expressing cells could already be detected at the level of steady-state mRNA, in the nucleus as well as in the cytoplasm. Divergent export rates of the mRNA variants from the nucleus, defective splice reactions or an altered mRNA stability as reason for the differential steady-state mRNA levels could be excluded. The analysis of the de novo synthesis rate of mRNA by means of a nuclear run-on revealed a direct and positive correlation between the amount of intragenic CpG dinucleotides within the open reading frame and an increase in transcriptional activity. The transient transfection of in vitro methylated plasmids and the determination of the methylation status of the stable cell lines by use of bisulphite sequencing revealed, that only unmethylated CpG dinucleotides could mediate the observed effect. For the protein human CFP1 (CXXC zinc finger protein1) it has been shown that it exclusively interacts with unmethylated CpG dinucleotides and that it activates transcription of the respective gene upon its binding. The existence of a homologous protein to the human CFP1 in CHO cells and the interaction of the DNA binding domain of this protein with the CpG-maximized cytokine gene variant could be proven in this work. The contribution of CFP1 on the transcription of the murine MIP-1a gene variants was examined in knock-down approaches by transfection of shRNA, however no clear statement could be drawn from this experiment.
In this work, the positive influence of unmethylated CpG dinucleotides within the open reading frame on the expression of a transgene could be clearly demonstrated, using the murine MIP-1a as an example. Concerning the development of efficiently working eukaryotic expression systems, the introduction of a maximal number of CpG dinucleotides into the open reading frame of the gene to be expressed should be taken into account in future considerations.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:20
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