| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Eingereichte Version Dissertation FW (11MB) | |
![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/other.png) | Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International Anderes - Zusätzliches Material RNA-Seq Daten (66MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-455330
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.45533
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 24 März 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Tag der Prüfung: | 24 März 2021 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Stichwörter / Keywords: | Saccharomyces cerevisiae, Translationsinitaiton, Zellzykluseintritt, Glukosemetabolismus |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 45533 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein fakultativ anaerober Organismus, deren bevorzugter Stoffwechsel in Anwesenheit von Sauerstoff und Glukose die Fermentation ist. Aerobe Fer-mentation findet auch in Tumorzellen statt, wie schon zuvor von Otto Warburg beschrieben. Hat die Hefe die Glukose verbraucht, kann sie den gewonnenen Ethanol als Kohlenstoff-quelle über die Atmung verwerten. In dieser ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein fakultativ anaerober Organismus, deren bevorzugter Stoffwechsel in Anwesenheit von Sauerstoff und Glukose die Fermentation ist. Aerobe Fer-mentation findet auch in Tumorzellen statt, wie schon zuvor von Otto Warburg beschrieben. Hat die Hefe die Glukose verbraucht, kann sie den gewonnenen Ethanol als Kohlenstoff-quelle über die Atmung verwerten. In dieser Phase sind Zellproliferation und Proteinbiosyn-these vermindert. Der eukaryotische Translationsinitiationsfaktor 2 (eIF2) spielt innerhalb der initiierenden Schritte der Proteinsynthese eine zentrale Rolle. Der eIF2-Komplex besteht aus 3 Untereinheiten (eIF2 α, β und γ), von denen die Untereinheit γ zu den GTPasen ge-hört. eIF2 bindet GTP und liefert die Initiator-Methionin-tRNA (tRNAiMet) an das Ribosom. Der gebildete Präinitiationskomplex, bestehend aus eIF2-GTP, der 40S (Svedberg) riboso-malen Untereinheit und anderen Initiationsfaktoren (43S-Präinitiationskomplex PIK), kann an die prozessierten mRNAs binden. Der 43S-PIK scannt die mRNA bis das Startcodon erreicht ist. Nachdem das Startcodon erkannt wurde, erfolgt die Termination des Scanning-prozesses. Hierbei ist der entscheidende Schritt die Hydrolyse des eIF2-GTP zu eIF2-GDP, gefolgt von der eIF2-Dissoziation vom Komplex. Durch die Katalyse von eIF2B, einem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, kann eIF2 für den nächsten Zyklus reaktiviert werden. Neben der Initiation der Translation hat eIF2 zudem eine regulatorische Funktion. Durch unterschiedliche Arten von Stress wie Aminosäuremangel, wird eIF2α durch verschiedene Kinasen phosphoryliert. Die Phosphorylierung von eIF2 interferiert mit dem Nukleotid-Austausch und führt zu einer Hemmung der globalen Translation. Gleichzeitig werden be-stimmte mRNAs, wie GCN4, verstärkt translatiert. Der Assemblierungsfaktor von eIF2, Cdc123, wurde zuerst in einer temperaturempfindlichen Ratten-Fibroblasten-Zelllinie be-schrieben. Diese Zellen konnten bei bestimmten Temperaturen nicht den G1/S-Übergang einleiten. In S. cerevisiae konnten Mutationen in CDC123 gleiche Zellzyklus Defekte auslö-sen. Somit ist das Protein nicht nur für eine richtige Assemblierung von eIF2 verantwortlich, sondern auch für den Zellzykluseintritt notwendig. Ergebnisse der Arbeitsgruppe zeigten, dass die Depletionen einer eIF2- oder einer eIF2B-Untereinheit zu einem verspäteten Zell-zykluseintritt führten. Dies konnte jedoch nicht bei anderen Initiationsfaktoren beobachtet werden. In dieser Arbeit wurde deshalb durch RNA-Sequenzierung untersucht, welche mRNAs auf eine verminderte eIF2 Funktion reagieren.
In der Arbeit war es möglich, durch die Störung der eIF2-Funktion eine veränderte Glukose-gesteuerte Genexpression zu detektieren. Mithilfe von RNA-Sequenzierungsdaten konnte durch unterschiedliche Analyseverfahren ein verändertes Expressionsmuster in den eIF2-Mutanten festgestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass neben der erhöhten Expressi-on der atmungsspezifischen Gene, die Mitochondrienstruktur in den eIF2-Mutanten verän-dert vorlag. Gene, die im Wachstum mit Glukose reprimiert vorliegen, wurden in den Trans-lationsinitia-tionsmutanten verstärkt abgelesen. Die verringerte Reg1-Menge, in den eIF2-Mutanten, ist möglicherweise für die erhöhte Snf1-Aktivität und die reduzierte Kernlokalisa-tion von Mig1 verantwortlich. Dadurch erfolgt eine Derepression der Glukose-reprimierten Gene. Zudem läuft vermutlich der glykolytische Fluss in den eIF2-Mutanten verlangsamt ab. Bei einer Deletion des Gens für die Trehalose-6-Phosphat Synthase (TPS1) kommt es zu einem unkontrollierten Zufluss von Glukose und zu einer Wachstumsunfähigkeit der Zellen. Die Doppeldeletion (tps1Δ cdc123-Δ326) konnte jedoch wieder auf Glukose wachsen. Dies bestätigt die Annahme des verminderten glykolytischen Flusses in der Mutante. Der verzö-gerte Zellzykluseintritt der eIF2-Mutane könnte eine Folge des verringerten glykolytischen Flusses sein, so wie es in den Einfachmutanten (hxk2Δ oder pfk1/2Δ) zu sehen war. Eine weitere Folge des reduzierten glykolytischen Flusses ist die reduzierte Menge von Fruktose-1,6-Bisphophat. Dies führt, durch weniger GTP-gebundenes Ras2, zu einem niedrigeren cAMP-Spiegel und dadurch einer verringerten PKA-Aktivität. Liegt eine reduzierte PKA-Aktivität vor, kommt es ebenfalls zu einem verzögerten Zellzykluseintritt. In der eIF2-Mutante war es durch ein dauerhaft aktives Ras2 möglich, den Zellzykluseintritt zu be-schleunigen. Die GFP fusionierte Pyruvatkinase Cdc19 bildete bei einer ausreichenden Glu-kosekonzentration Kondensate. Lag ein verringerter glykolytischer Fluss (durch hxk2Δ oder pfk1/2Δ) oder eine verminderte PKA-Aktivität (durch pTEF-PDE2) vor, so wurden weniger Kondensate detektiert. In der eIF2-Mutante wurden ebenfalls kaum Cdc19-GFP-Kondensate gefunden. Die gefundene Struktur wirkt als eine Art Indikator für einen schnel-len glykolytischen Fluss, der in den eIF2-Mutanten wahrscheinlich verlangsamt abläuft. Die Inhibierung der Translationsinitiation führt allen Anschein nach zu einer verstärkten At-mung, gekoppelt mit einem verminderten glykolytischen Fluss.
Die gesamten Ergebnisse deuten auf einen veränderten Metabolismus im Zuge der vermin-derten eIF2-Funktion hin. Dieser veränderte Stoffwechsel könnte der Auslöser für die ver-langsamte Zellproliferation sein. In Tumorzellen wurden unterschiedliche Ansätze angewen-det, um den glykolytischen Fluss und die damit verbundene Zellproliferation zu inhibieren. Eine mögliche eIF2 spezifische Metabolismus-Änderung, die einen verlangsamten Zellzyk-luseintritt nach sich zieht, macht eIF2 zu einem interessanten Kandidaten in der Krebsfor-schung.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The baker's yeast S. cerevisiae is a facultative anaerobic organism. Its preferred metabolism in the presence of oxygen and glucose is fermentation. Aerobic fermentation takes place also in tumor cells, as first described by Otto Warburg. Once yeast has consumed the glucose, it can utilize the obtained ethanol as a carbon source via respiration. Cell proliferation and protein biosynthesis are ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The baker's yeast S. cerevisiae is a facultative anaerobic organism. Its preferred metabolism in the presence of oxygen and glucose is fermentation. Aerobic fermentation takes place also in tumor cells, as first described by Otto Warburg. Once yeast has consumed the glucose, it can utilize the obtained ethanol as a carbon source via respiration. Cell proliferation and protein biosynthesis are reduced during this phase. The eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2) plays a central role within the initiating steps of protein synthesis. The eIF2 complex consists of 3 subunits (eIF2 α, β and γ), whereof the γ subunit belongs to the GTPases. eIF2 binds GTP and delivers the initiator methionine-tRNA (tRNAiMet) to the ribosomes. The formed initiation complex, consisting of eIF2-GTP, the 40S ribosomal subunit and other initiation factors (43S-preinitiation complex PIC), can further bind processed mRNAs. The 43S-PIC is scanning the mRNA until reaching of the start codon. After start codon recogni-tion the scanning process is terminated. The determining step is the hydrolysis of the eIF2-GTP to eIF2-GDP and consequently the dissociation of eIF2 from the complex. eIF2 can be reactivated for the next cycle by catalysis of eIF2B, a guanine nucleotide exchange factor. In addition to its role in the translation initiation mechanism, eIF2 also has a regulatory func-tion. Through different forms of stress, for example amino acid starvation, the α subunit of eIF2 becomes phosphorylated by specific kinases. The phosphorylation of eIF2 interferes with nucleotide exchange and leads to an inhibition of the global translation and at the same time an up-regulation of certain mRNAs like GCN4. The assembly factor of eIF2, Cdc123, was first described in a temperature-sensitive rat fibroblast cell line, which was not compe-tent for a G1/S-transition at the restrictive temperature. Similar cell cycle defects were also caused by CDC123 mutations in S. cerevisiae. Thus, the protein is not only responsible for the correct assembly of eIF2, but it is also necessary for cell cycle entry. Work in the lab showed that depletions of subunits of eIF2 or eIF2B led to a delayed cell cycle entry. However, this could not be observed with other initiation factors. In this thesis it is therefore investigated by RNA sequencing which mRNAs react to a reduced eIF2 function.
In this work, it was possible to detect altered glucose-controlled gene expression due to the disruption of the eIF2 function. With the help of RNA sequencing data, a changed expres-sion pattern in the eIF2 mutants could be detected by different methods. It could be shown that in addition to the increased expression of the respiration-specific genes, the mitochon-drial structure in the eIF2 mutants was altered. Genes that are repressed in growth with glu-cose were increasingly transcribed in translation initiation mutants. The reduced amount of Reg1 in the eIF2 mutants may be responsible for the increased Snf1 activity and reduced nuclear localization of Mig1. This leads to a derepression of the glucose repressed genes. Additionally, the glycolytic flux is probably reduced in the eIF2 mutants. A deletion of the gene for trehalose-6-phosphate synthase (TPS1) leads to an uncontrolled influx of glucose and to an inability of the cells to grow. However, the double deletion (tps1Δ cdc123-Δ326) could grow on glucose. This confirms the assumption of reduced glycolytic flux in the mu-tants. The delayed cell cycle entry of the eIF2 mutant could be a consequence of the de-creased glycolytic flux as seen in the single mutants (hxk2Δ or pfk1/2Δ). Another conse-quence of the lowered glycolytic flux is the reduced amount of fructose-1,6-bisphophate. This leads to reduced PKA activity due to less GTP-bound Ras2. Decreased PKA activity because of low cAMP level is a known cause of delayed cell cycle entry. In the eIF2 mutant it was possible to accelerate cell cycle entry by a constitutive active Ras2. The GFP fused pyruvate kinase, Cdc19, formed condensates at a sufficient glucose concentration. In case of a decreased glycolytic flux (through hxk2Δ or pfk1/2Δ) or a reduced PKA activity (through pTEF-PDE2), fewer condensates were detected. In the eIF2 mutant also hardly any Cdc19-GFP condensates were found. The structure may serve as an indicator for a high glycolytic flux, which is probably at a slower rate in the eIF2 mutants. Inhibition of translation initia-tion seems to lead to increased respiration coupled with a reduced glycolytic flux.
Overall, the results indicate an altered metabolism due to the decreased eIF2 function. This altered metabolism could be the cause for the reduced cell proliferation. Different approach-es have been used in tumor cells to inhibit glycolytic flux and the associated cell prolifera-tion. A possible eIF2-specific metabolic change, which results in a slower cell cycle entry, makes eIF2 an interesting candidate in cancer research.
Metadaten zuletzt geändert: 24 Mrz 2022 07:24
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik